丁同燕 ,孫虎芝 ,王 倩 ,付靜蕓 ,邱麗萍 ,宋曉娜 ,潘 強,張召佐,任慧英

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,山東青島266109 ;2.青島諾安百特生物技術有限公司,山東青島 266109)

副溶血弧菌又稱作嗜鹽菌,是一種革蘭陰性桿菌,分布范圍廣,主要來自生活在海水中的魚、蝦和貝類[1-2]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)發(fā)布報告稱,一種被稱為“對蝦早期死亡綜合征(EMS)”的弧菌病導致亞洲許多國家的養(yǎng)殖蝦出現(xiàn)肝胰腺萎縮甚至死亡的現(xiàn)象,經(jīng)美國亞利桑那大學的科研人員研究表明,副溶血弧菌是引起蝦感染EMS 的主要原因。中國華南地區(qū)的EMS 相對別的地處暴發(fā)較嚴重,在養(yǎng)殖過程中掉苗率較高,這給對蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[3]。副溶血弧菌主要經(jīng)過蝦的口腔定植在消化道,引起腹瀉并破壞腸道,造成空腸空胃甚至死亡等嚴重問題[4]。

噬菌體具有對細菌有特異性、高效性、殺傷性等特點,只對特定的目標菌感染并裂解,是安全、綠色的生物防治主要手段[5]。噬菌體分為溫和噬菌體與烈性噬菌體兩類,烈性噬菌體可以在不損壞正常菌群的情況下裂解目標細菌[6]。噬菌體在殺菌的同時可以進行自我復制增殖,作為抗生素替代品已經(jīng)越來越受到人們的重視[7]。在本試驗中,篩選裂解譜寬的副溶血弧菌噬菌體并研究其生物學特性,擴充噬菌體儲備庫,為開發(fā)治療EMS 的抗生素替代品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 分離噬菌體的樣本來自山東煙臺海陽養(yǎng)蝦池的水樣;副溶血弧菌標準菌株7088 來自青島農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室。

1.2 副溶血弧菌的分離培養(yǎng)及鑒定 取水樣80 mL離心過濾棄上清,沉淀用5 mL 2216E 肉湯懸浮,取100 μL 懸浮液涂布于TCBS 平板,37 ℃培養(yǎng)12 h[8]。挑取藍綠色單菌落,并使用副溶血弧菌特異性引物對疑似副溶血弧菌進行PCR 擴增檢測。特異性PCR 引物來自副溶血弧菌菌株ToxR的基因,上游引物:5′-ATA CGA GTG GTT GCT GTC ATG-3′,下游引物:5′-GTC TTC TGA CGC AAT CGT TG-3′,擴增片段長度為400 bp。PCR 擴增條件:94 ℃5 min;94 ℃1 min,60 ℃1 min,72 ℃1 min,29 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR 產(chǎn)物[9-11]。

1.3 副溶血弧菌噬菌體的分離與鑒定 向盛有100 mL 2 倍濃縮的2216E 肉湯的錐形瓶里加入100 mL 水樣,并加入已鑒定到的10 株副溶血弧菌500 μL,37 ℃培養(yǎng)過夜。取出8 mL 增殖液,11 000 rmin 離心10 min,將上清通過0.22 μm 濾器過濾,得到噬菌體增殖原液。

利用雙層平板法分離噬菌體,將100 μL 噬菌體原液與100 μL 宿主菌增殖液均勻混合,37 ℃孵育5 min后,取混合液置于約50 ℃保溫的上層瓊脂(瓊脂濃度為0.7%),混勻后迅速傾倒在下層營養(yǎng)瓊脂(瓊脂濃度為1.5%)上,充分搖勻。平置至培養(yǎng)基凝固,37 ℃倒置培養(yǎng)6 -8 h。如果存在噬菌體,則在培養(yǎng)基上形成規(guī)則的透明圓形噬菌斑。

摳取噬菌斑置于盛有1 mL PBS 緩沖液的EP管中,42 ℃水浴30 min。將浸出液12 000 r/min 離心5 min,上清用PBS 緩沖液進行10 倍倍比稀釋至合適的稀釋度,使用雙層平板法得到單個噬菌斑。連續(xù)純化3～5 次,直至獲得相同大小和形態(tài)的噬菌斑。

摳取形態(tài)一致的單個噬菌斑置于盛有1 mL PBS緩沖液的EP 管中,42 ℃水浴30 min。將浸出液12 000 r/min 離心5 min,取100 μL 上清與200 μL 宿主菌于5 mL 2216E 肉湯中,37 ℃搖床培養(yǎng)(170 r/min),試管內(nèi)增殖液先渾濁后澄清,澄清后取出,進行噬菌體效價的測定[9-11]。

1.4 噬菌體的生物學特性

1.4.1 噬菌體形態(tài)觀察 將10 倍濃縮噬菌體液20 μL 滴加到銅網(wǎng)上,靜置沉降15 min 后,使噬菌體液充分進入微孔中,用濾紙吸去多余液體,在封口膜上先加15 μL 2%的磷鎢酸(PTA)染色溶液,將經(jīng)過的銅網(wǎng)倒扣在磷鎢酸上,染色5 min,并用濾紙吸取過多的染液,用烤燈干燥10 min,干燥后用日立透射電子顯微鏡HT7700 觀察[9-11]。

1.4.2 噬菌體裂解譜的測定 采用點樣法進行裂解譜的測定。取100 μL 菌懸液加入5 mL 上層瓊脂培養(yǎng)基(50 ℃),充分混勻,并迅速鋪到底層瓊脂板上。取噬菌體1 μL 點到雙層平板上,37 ℃溫箱中培養(yǎng)10 h[9-11]。

1.4.3 噬菌體最適感染復數(shù)(MOI)的測定 根據(jù)不同MOI 比例將噬菌體與宿主菌加入到2216E 肉湯試管中,37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)3 h 至澄清,使用雙層平板法測效價[9-11]。

1.4.4 一步生長曲線的測定 以MOI 為10 的比例加入500 μL vB_VpS_PG08 及500 μL 宿主菌,37 ℃孵育10 min,13 000 r/min 離心30 s。通過2216E 肉湯洗滌2 次除去未吸附的噬菌體。將沉淀置于10 mL離心管中,加入2216E 肉湯至5 mL,立即置于37 ℃搖床培養(yǎng)(170 r/min)。0 min 取樣一次,前2 h 每隔10 min 取樣一次。后2 h 每隔30 min 取一次。取出200 μL 噬菌體增殖液,12 000 r/min 離心5 min 后取100 μL 上清,10 倍倍比稀釋后用雙層平板法測定噬菌體的效價[9-11]。

1.4.5 溫度穩(wěn)定性試驗 在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃水浴中分別放置含有200 μL 8.7 ×108PFU/mL噬菌體的1.5 mL 離心管,每個溫度設有3 個重復,作用不同時間后通過雙層平板法測定噬菌體效價,繪制噬菌體對溫度的敏感性曲線[9-11]。

1.4.6 pH 值穩(wěn)定性試驗 取效價為5.3 ×108PFU/mL 噬菌體增殖液加入到不同pH 值的PBS(pH 值2 ～13)中。 在37 ℃條件下分別作用1 h、2 h、3 h，將pH 值用HCl 與NaOH 調(diào)回為7.0，10 倍倍比稀釋后測定噬菌體效價，繪制噬菌體效價在不同pH 值下隨時間的變化曲線[9-11]。

1.4.7 噬菌體對紫外線的穩(wěn)定性 取5 mL 效價為3.15 ×108PFU/mL 噬菌體增殖液于75 mm 無菌平皿中。 打開蓋子，置于LED 紫外燈(功率15 W)下50 cm 處連續(xù)照射。 在0 s、10 s、20 s、30 s、1 min、3 min、9 min 取噬菌體液進行噬菌體效價測定，繪制噬菌體效價隨紫外線照射時間的變化曲線[9-11]。

1.4.8 噬菌體對氯仿的穩(wěn)定性 將增殖好的效價為2 ×108PFU/mL 噬菌體中加入2.5%的氯仿，在37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)30 min，12 000 r/min 離心5 min，取上層液體測噬菌體效價，設不加氯仿的對照。 評價噬菌體對氯仿的穩(wěn)定性[9-11]。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離 從養(yǎng)殖水樣中進行副溶血弧菌的分離，經(jīng)初步篩選共獲得疑似副溶血弧菌15 株。用副溶血弧菌特異性引物進行PCR 擴增檢測，鑒定出3 株副溶血弧菌。

2.2 噬菌體的分離 以副溶血弧菌標準株7088 及分離株為宿主菌進行噬菌體的分離。 經(jīng)過3 代分離純化后，噬菌體在雙層平板上形成直徑2 mm 左右、規(guī)則透明的噬菌斑(圖1A)。

2.3 噬菌體電鏡觀察 電鏡下該噬菌體為有尾噬菌體，由頭部和尾部兩部分組成，頭部呈正二十面體，直徑約為60 nm；有一個非收縮性尾部，長約140 nm，尾端可見明顯爪刺樣結(jié)構(gòu)(圖1B)，上述形態(tài)特征說明該噬菌體為長尾噬菌體。 根據(jù)噬菌體的宿主名稱，按照噬菌體命名規(guī)則，將其命名為vB_VpS_PG08[12]。

2.4 噬菌體裂解譜的測定 噬菌體vB_VpS_PG08可裂解22 株副溶血弧菌的裂解率達32%。 22 株副溶血弧菌來自不同地區(qū)的養(yǎng)殖池水樣，說明vB_VpS_PG08 是寬裂解譜噬菌體。

圖1 噬菌體分離株形成的噬菌斑(A)、噬菌體vB_VpS_PG08電鏡下形態(tài)(B)(圖中標識為200 nm)

2.5 噬菌體最佳MOI 測定 如表1 所示，當MOI =0.01 時，侵染宿主菌并裂解出的子代噬菌體效價最高為2.2 ×109PFU/mL，噬菌體vB_VpS_PG08 的MOI 為0.01。

表1 vB_VpS_PG08 最適MOI 的測定

2.6 噬菌體溫度穩(wěn)定性試驗 vB_VpS_PG08 的溫度穩(wěn)定性曲線見圖2。 vB_VpS_PG08 在40 ℃及50 ℃基本保持原活性，在60 ℃作用20 min 噬菌體的效價從108PFU/mL 下降到106PFU/mL，作用60 min下降到104PFU/mL；70 ℃作用40 min 完全失活;80 ℃作用20 min 噬菌體完全失活。結(jié)果表明,當溫度低于50 ℃時,該噬菌體較為穩(wěn)定,60 ℃時隨著時間延長耐受性降低,在70 ℃和80 ℃時裂解活性喪失。

圖2 噬菌體vB_VpS_PG08 溫度穩(wěn)定性

2.7 噬菌體pH 值穩(wěn)定性試驗 vB_VpS_PG08的pH 值穩(wěn)定性曲線(圖3)。噬菌體vB_VpS_PG08 在pH 值4～10 范圍內(nèi)都有較高的效價,說明該噬菌體有較寬的pH 值耐受性,噬菌體在pH值2 時效價為0,而在pH 值11.0 時仍具有較高的效價,在1 h 后達到106PFU/mL,說明此噬菌體具有耐堿不耐酸的特性。在pH 值7～9 之間噬菌體的效價達到最高,表明它在該pH 值范圍內(nèi)最穩(wěn)定,活性最強,即該噬菌體的最適pH 值為7～9。

圖3 噬菌體vB_VpS_PG08 pH 穩(wěn)定性

2.8 噬菌體vB_VpS_PG08 對紫外線及氯仿的穩(wěn)定性 噬菌體vB_VpS_PG08 紫外線穩(wěn)定性結(jié)果見圖4,其顯示在較短時間內(nèi)紫外線對噬菌體具有較強的影響。在用紫外線燈照射9 min 后,平板上噬菌斑再沒出現(xiàn)。噬菌體的活性不受有機溶劑氯仿影響(圖5)。

2.9 噬菌體一步生長曲線 噬菌體vB_VpS_PG08的一步生長曲線(圖6)。潛伏期約為20 min,暴發(fā)期約30 min,之后趨于穩(wěn)定,暴發(fā)量為55。

圖4 噬菌體vB_VpS_PG08 紫外線穩(wěn)定性

圖5 噬菌體vB_VpS_PG08 的氯仿敏感性

圖6 噬菌體vB_VpS_PG08 一步生長曲線

3 討論

細菌的嚴重耐藥性已成為全球公共安全問題。在2011 年,世界衛(wèi)生組織(OIE)提出了“遏制耐藥-今天不采取行動,明天就無藥可用”的呼吁[13]。我國的多重耐藥細菌檢出率很高,但各部門在臨床應用中一直非常重視抗菌藥物的控制。近幾年,積極開展一系列耐藥控制行動[14]。2018 年5 月26日,國家衛(wèi)生與健康委員會發(fā)布了“關于持續(xù)做好抗菌藥物臨床應用管理有關工作的通知”,強調(diào)加快建立多學科抗菌藥物管理和診療團隊,加強抗菌藥物的臨床應用管理,限制抗生素的使用再次升級[15]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中使用抗生素如在人體中使用抗生素,不僅會對目標菌株產(chǎn)生抗藥性,還會破壞機體內(nèi)存在的各種正常菌群。水體是一個大環(huán)境,占地球表面積的71.9%,且大部分為咸水存在[16]。水生動物體內(nèi)的耐藥菌群越多,它們就越有可能傳播到環(huán)境中。利用消毒劑和抗生素防治病原菌變得越來越困難,而用噬菌體防治疾病可以解決這些問題[17]。噬菌體是一種廣泛存在于自然界中的病毒,可以特異性地感染并裂解細菌,且對動物和環(huán)境是綠色友好的,噬菌體及其裂解酶也必將在我國甚至世界的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮出極其重要的作用[18]。

本試驗在9 月份之前是從各地養(yǎng)殖蝦池中采集水樣分離噬菌體,但效果都不是很明顯。相比之下,發(fā)現(xiàn)在海鮮市場下水道中分離的副溶血弧菌噬菌體較多。采樣地點和采樣時間的分析對成功分離副溶血弧菌噬菌體有著很大影響[19]。噬菌體vB_VpS_PG08 屬于有尾病毒目長尾噬菌體科,對不同來源的22 株副溶血弧菌的裂解率為32%。表明它是一株具有臨床應用價值的噬菌體[20]。溫度、pH值等的變化可直接對噬菌體理化性質(zhì)和生物學活性產(chǎn)生重要影響。噬菌體vB_VpS_PG08 在低于50 ℃的溫度下穩(wěn)定,60 ℃時隨著時間的延長耐受性降低,在70 ℃和80 ℃時失去裂解活性。噬菌體vB_VpS_PG08 在pH 值4～9 時的PBS 緩沖液中作用3 h 后仍具有較高的活性,穩(wěn)定性較好。說明該噬菌體具有較寬的溫度和酸堿度適用范圍,可以通過向養(yǎng)殖池里添加噬菌體達到蝦攝取藥物的目的[21]。噬菌體vB_VpS_PG08 在紫外線下連續(xù)照射9 min 后,平板上再沒出現(xiàn)噬菌斑,證明副溶血弧菌噬菌體對紫外線敏感。因此,副溶血弧菌噬菌體使用可以考慮清晨或者傍晚在魚蝦養(yǎng)殖池中投放,或通過包被等技術使其沉于水塘底部,以避免陽光照射引起的噬菌體活性下降[22]。

根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計,全球的水產(chǎn)品產(chǎn)量早已進入穩(wěn)定的增長期。中國有近1 000 萬公頃的水產(chǎn)養(yǎng)殖面積,約占世界的80%。在魚和蝦的病害方面,數(shù)量可達200 多種,所以水產(chǎn)養(yǎng)殖動物用藥有著很大的潛在市場[23]。本試驗從海陽養(yǎng)殖池水樣中分離出一株較強裂解性副溶血性弧菌噬菌體vB_VpS_PG08,并對其生物學特性進行了分析,為副溶血弧菌噬菌體的研究以及相關藥物的開發(fā)奠定了基礎。