楊菊鳳 ,劉琴華 ,杜迎春 ,李秀麗 ,田慧麗 ,郭瑞萍 ,溫青娜

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院動物科技系,山東濰坊261061 ;2.河南科技學院高等職業(yè)技術學院,河南新鄉(xiāng)453646 ;3.北京市水生野生動植物救護中心,北京延慶 102100)

立克次氏體(Rickettsia)是一類大小介于細菌和病毒之間,且更接近于細菌的一類原核微生物,該類微生物革蘭染色陰性,專性寄生于真核細胞的原核單細胞微生物,為紀念發(fā)現(xiàn)洛杉磯斑點熱病原體的美國醫(yī)生Howard Taylor Ricketts 而命名[1]。立克次體屬(Rickettsia)的立克次體分為2 個群,即斑疹傷寒群立克次體(Typhus GroupRickettsiae)和斑點熱群立克次體(Spotted Fever GroupRickettsiae,SFGR)[1-3]。我國于1958 年首次在血清學上證實了斑點熱群立克次體的存在;并于1962 年從黑龍江虎饒地區(qū)東方田鼠(Microtus fortis)體內首次分離到了斑點熱群西伯利亞立克次體(R.siberian)[1]。蜱是一類重要的醫(yī)學節(jié)肢動物,專性寄生于哺乳類、爬行類、鳥類等動物的體表。蜱傳斑點熱群立克次體疾病是一類由蜱傳播的自然疫源性疾病,由于動物宿主的存在,它們在某一地區(qū)長期存在和流行,人進入疫源地就可能被蜱叮咬而感染發(fā)病[4-5]。目前我國西北部省區(qū)優(yōu)勢媒介蜱種傳斑點熱立克次體的遺傳變異及其多樣性研究較少,是否存在新的SFGR 變種尚需詳實的分子流行病學資料。在此我們采用PCR 方法擴增青海省優(yōu)勢蜱種青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)攜帶斑點熱群立克次體的外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)基因,并構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹進行斑點熱群立克次體的遺傳進化分析,以明確青海血蜱斑點熱群立克次體帶菌率及遺傳進化規(guī)律,為制定蜱傳斑點熱的有效防治措施提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 青海血蜱標本采集及種類鑒定 我們于2013年5 月-2014 年10 月,在青海省天峻縣的新源鎮(zhèn)、陽康鄉(xiāng)、龍門鄉(xiāng)、快爾瑪鄉(xiāng)和舟群鄉(xiāng)等5 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的放牧牛、羊體表及野外生境中進行青海血蜱標本采集。在進行放牧牛、羊體表蜱標本采集的時候用鑷子輕輕夾取蜱蟲,小心拔下,防止蜱蟲頭節(jié)斷裂在動物皮膚內,或用點燃的香煙頭灼燙蜱蟲臀部,待其自行從動物體表離開,用鑷子夾取,放進裝有昆蟲保存液的青霉素小瓶。我們采用布旗法進行野外生境中青海血蜱標本的采集。手持布旗在野外生態(tài)環(huán)境中拖拽布旗,行走50 m 左右時,翻轉布旗,查找布旗表面的爬行蜱蟲,用鑷子夾取,放進裝有昆蟲保存液的青霉素小瓶夾取蜱標本放入盛有昆蟲保存液的采集瓶中[6-7]。

1.2 青海血蜱基因組DNA 提取 先將采集到的青海血蜱標本進行75%酒精消毒,然后無菌PBS 洗滌3 次,濾紙吸干。將采集的3～8 只未飽血或1～3只飽血的蜱標本作為一個樣品池于白色乳缽內,加液氮研磨至粉末后移入1.5 mL 離心管中。采用商業(yè)化的基因組提取試劑盒提取基因組(北京元和醫(yī)療科技有限公司),-20 ℃保存?zhèn)溆肹5]。

1.3 SFGROmpA基因PCR 擴增 根據已發(fā)表文獻SFGR 190 kDOmpA基因合成引物序列。引物序列為:SFGR-F:5′-ATG GCG AAT ATT TCT CCA AAA-3′;SFGR-R:5′-GTT CCG TTA ATG GCA GCA TCT-3′,目的片段長度約為631 bp (Rr190.70 p/Rr190.701 n),上述引物序列由英濰捷基公司合成[5-6]。PCR 反應體系(50 μL):SFGR-F(10 pmol/mL)和SFGR-R(10 pmol/mL)引物各1 μL;DNA 模板1 μL;2×TaqPCR Master Mix(北京康為世紀生物科技有限公司)25 μL;無RNA 酶H2O 22 μL。反應條件:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;72 ℃終延伸10 min。在本PCR反應中我們同時設置陰性及陽性PCR 對照反應,以無菌PBS 為陰性對照,以感染SFGR 的蜱標本DNA(來源于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所)為陽性對照。

1.4 序列測定及分子系統(tǒng)進化樹分析 取SFGROmp A基因PCR 擴增產物10 μL 進行瓊脂糖電泳;取經電泳檢測陽性PCR 產物50 μL 送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序;雙向測序結果經DNA STAR 軟件包EDIT 程序編輯拼裝后,與GenBank 中發(fā)表的SFGROmp A基因序列進行序列一致性比對分析,然后利用DNA MAN 及MEGA 6.06 進行SFGR 同源性及遺傳進化分析。

2 結果

2.1 PCR 電泳結果 我們于2013 年5 月-2014年10 月在青海省天峻縣的5 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的放牧牛、羊體表及野外生境中進行青海血蜱標本采集。在本次調查中我們共采集了5 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的23 個牛、羊養(yǎng)殖場及牛、羊放牧的野外生境蜱標本,經蜱形態(tài)學鑒定共收集青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)1 548只,分為316 個青海血蜱標本樣品池。經SFGROmpA基因PCR 檢測,在316 個青海血蜱標本樣品池中共檢測到31 個樣品的陽性電泳條帶,與預期SFGROmpA基因電泳條帶位置一致,青海省天峻地區(qū)青海血蜱SFGR 帶菌率為9.8%。見圖1。

圖1 PCR 擴增SFGR ompA 基因(約631 bp)

2.2 序列測定與結果分析 我們對本試驗檢測到的31 個陽性SFGR 樣品的OmpA基因進行雙向測序,序列一致性比對分析結果顯示,本試驗獲得的31 個SFGROmpA基因序列一致性為100%。我們選取樣品編號為TJ013 的陽性樣品SFGROmpA基因序列進行GenBank Blast 分析,并選取GenBank 中的SFGROmpA基因序列建立分子遺傳進化樹進行遺傳進化分析,結果顯示,TJ013 與立克次體福建分離株FUJ98(AF169629)處于同一分支;黑龍江立克次體HL-93(AF179364)及HL-054(AF179362)與日本立克次體YM(U43795)處于一個分支;且上述兩個分支又處于一個較大的分支。SFGROmpA基因序列同源性分析結果顯示,TJ013 與立克次體福建分離株FUJ98(AF169629)同源性最高,為95.49%;與其他斑點熱群立克次體的同源性小于95%,其中與黑龍江立克次體綏芬分離株HLJ-054 和虎林分離株HL-93 的同源性均為91.44%;和日本立克次體YM 同源性為90.24%,同一分支中同源性最低。

圖2 斑點熱群立克次體OmpA 基因遺傳進化分析

3 討論

2006 年我國首次報道了安徽省蕪湖10 例無形體病確診病例,其中1 例死亡[8-9]。2007 年5 月-2010 年9 月期間,河南省共監(jiān)測和報告蜱蟲叮咬后出現(xiàn)發(fā)熱伴血小板減少綜合征、疑似無形體病病例557 例,其中18 例死亡。2011 年通過序列非依賴核酸擴增技術結合電子顯微鏡形態(tài)學分析,初步確定通過蜱蟲導致18 人死亡的病原為布尼亞病毒科白嶺病毒屬的一種新病毒,命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV),本病毒由蜱進行傳播,但其媒介蜱種范圍還不十分明確,導致了嚴重的公共衛(wèi)生問題[10]。蜱傳斑點熱群立克次體(SFGR)疾病是一類由蜱傳播的斑點熱群立克次體中病原性立克次體引起的[11],以急性發(fā)熱和皮疹為主要癥狀的自然疫源性疾病。該群立克次體為專性細胞內寄生微生物,蜱、螨為其保存宿主,可經期、經卵垂直傳遞立克次體,保持其種群的連續(xù)性。此外,由于動物宿主的廣泛存在,它們在某一地區(qū)長期存在和流行,人進入疫源地就可能被蜱叮咬而感染發(fā)病。青海血蜱作為我國西北部地區(qū)特有的、優(yōu)勢的蜱種,探究青海血蜱SFGR 帶菌率具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

本試驗通過分子生物學和生物信息學的方法,對青海省天峻地區(qū)青海血蜱斑點熱群立克次體帶菌率進行分子流行病毒調查及流行菌株的遺傳進化分析和鑒定。結果顯示,在316 個青海血蜱標本樣品池中共檢測到31 個樣品的陽性電泳條帶,與預期SFGROmpA基因電泳條帶位置一致,青海省天峻地區(qū)青海血蜱SFGR 帶菌率為9.8%。與以往的研究相比,青海血蜱SFGR 帶菌率高于河北省長角血蜱SFGR 的帶菌率(6.9%～7.42%),寄生蜱種的差異可能是SFGR 帶菌率差異的主要原因[4-5,11]。

OmpA和OmpB基因是編碼SFGR 外膜蛋白的基因,其中OmpA基因是SFGR 的特異性外膜蛋白基因,不同種SFGR 的外膜蛋白編碼基因OmpA表現(xiàn)出種的差異性,對斑點熱群立克次體的基因型或其亞型鑒定及分類具有重要意義。此外,OmpA基因還可以準確把握SFGR 的遺傳變異特征。在本試驗中我們通過構建SFGROmpA基因分子系統(tǒng)進化樹及基因序列一致性分析,獲得的31 個SFGROmpA基因序列一致性為100%,因此我們選取TJ013 作為代表菌株進行后續(xù)的遺傳進化分析;遺傳進化分析表明,TJ013 與立克次體福建分離株FUJ98(AF169629)處于同一分支;黑龍江立克次體HL-93(AF179364)及HL-054(AF179362)與日本立克次體YM(U43795)處于一個分支;且上述兩個分支又處于一個較大的分支。提示東亞地區(qū)斑點熱群立克次體的外膜蛋白OmpA基因變異不大,親緣關系較近。但是SFGROmpA基因序列同源性分析結果顯示,TJ013 與立克次體福建分離株FUJ98(AF169629)同源性最高,為95.49%;與其他斑點熱群立克次體的同源性小于95%,其中與黑龍江立克次體綏芬分離株HLJ-054 和虎林分離株HL-93 的同源性均為91.44%;和日本立克次體YM 同源性為90.24%,同一分支中同源性最低。提示我們本次檢測到的斑點熱群立克次體可能是一個新種,且與福建立克次體具有較高的淵源,可能因為是全球氣候變暖使得熱帶地區(qū)范圍擴大,一些原先僅限于該地區(qū)的病毒、細菌、寄生蟲等也出現(xiàn)在溫帶甚至寒帶。也有可能隨著人口的快速增長,人類活動區(qū)域不斷向蜱蟲棲息地擴展,逼迫蜱蟲遷移,將“毒”帶入新的區(qū)域環(huán)境,在氣候和地理生態(tài)環(huán)境的雙重作用下引起核酸序列部分堿基的變異,導致斑點熱群立克次體新種的形成。

通過本次對青海省天峻地區(qū)青海血蜱SFGR 帶菌率的分子流行病學調查,明確了青海血蜱SFGR的帶菌率;遺傳進化分析顯示本次檢測到的SFGR可能為一新種立克次體,為蜱傳斑點熱的防控提供基礎科學依據。