薛逸軒，王菁，肖世娣，張惠玲

（寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

干化葡萄酒是在葡萄完全成熟后并推遲采摘，在自然條件下進(jìn)行干化處理，葡萄果實(shí)適度失水，可增加糖度、積累香氣，使果實(shí)物質(zhì)濃縮。當(dāng)葡萄原料的糖度等指標(biāo)達(dá)到工藝要求時(shí)，除梗破碎、浸漬發(fā)酵，陳釀后得到風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)質(zhì)干紅葡萄酒[1]。

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是葡萄酒在釀造過程中產(chǎn)生的一種副產(chǎn)物，具有一定程度的致癌性，隨著對(duì)葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成機(jī)理的深入研究，發(fā)現(xiàn)酒中的氨基甲酸乙酯是乙醇和尿素、瓜胺酸等在偏酸性的條件下為主要途徑生成的。干化葡萄酒相較于其他類型的葡萄酒乙醇含量較高，酒體中氨基甲酸乙酯含量就與酒精度大小有直接的關(guān)系。另外，不同的陳釀方式提供光照、酸堿環(huán)境以及氧氣濃度的不同是造成氨基甲酸乙酯生成的關(guān)鍵影響因素[2]。

本試驗(yàn)對(duì)兩種不同陳釀方式的干化葡萄酒進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)、氨基甲酸乙酯含量測定分析并進(jìn)行對(duì)比，獲得適合于干化葡萄酒的陳釀方式，為改善葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)和控制氨基甲酸乙酯的生成提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

赤霞珠葡萄：2016年寧夏賀蘭山東麓地區(qū)；亞硫酸（食品級(jí)）：陜西芳草地工貿(mào)有限責(zé)任公司；XR 型釀酒活性干酵母、OENO 1 型乳酸菌：法國Lamothe-Abiet公司；果膠酶，7500PGNU：丹麥Novozymes 公司。

氨基甲酸乙酯（純度≥99.0%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氨基甲酸丙酯（純度≥98.0%）：Toronto Research Chemicals Inc；甲醇、正己烷：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷：天津市大茂化學(xué)試劑廠。以上試劑均為高效液相色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀：日本島津公司；手動(dòng)固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）裝置：美國 Supelco 公司；DB-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）、DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱 （30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）、ChemElut 萃取柱12198006：美國安捷倫科技有限公司；NBS-I 型氮吹儀：合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；HHS-21-6 型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；225L 橡木桶：法國 Seguin Moreau。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 干化葡萄酒制備

1）原料預(yù)處理

在衛(wèi)生、空曠、干燥、通風(fēng)狀態(tài)良好的室內(nèi)拉好鐵絲，每行鐵絲相隔50 cm，葡萄采收后，將葡萄懸掛于鐵絲上，每串葡萄間隔10 cm 進(jìn)行干化處理，每天對(duì)葡萄顆粒的品質(zhì)進(jìn)行觀察，確保每顆葡萄無腐爛、無霉變、無污染，如果有腐爛霉變的果實(shí)及時(shí)剔除。需要時(shí)可適當(dāng)噴撒亞硫酸（食品級(jí)）進(jìn)行防腐處理[3]，當(dāng)葡萄含糖的達(dá)到35%左右即可。除梗破碎入不銹鋼發(fā)酵罐（600 L），按照 60.00 mg/L 添加 6 %亞硫酸（食品級(jí)），根據(jù)40.00 mg/L 的比例添加果膠酶，于10 ℃條件下浸漬7 d。

2）活化酵母

按0.20 g/L 稱取活性釀酒酵母粉，37 ℃水浴活化30 min，在活化過程中加入少量葡萄汁，使釀酒酵母適應(yīng)葡萄汁發(fā)酵環(huán)境，備用。

3）接種發(fā)酵

在處理好的發(fā)酵罐中，接入活化好的酵母菌，于18 ℃～20 ℃低溫條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵，期間定時(shí)打循環(huán)，測定葡萄酒溫度、比重，并壓帽。

4）皮渣分離

當(dāng)比重小于0.996，還原糖含量在4.00 g/L 左右時(shí)進(jìn)行皮渣分離，倒罐澄清，接種乳酸菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵[4]。

5）陳釀

發(fā)酵結(jié)束后，將其下膠過濾，得到的清澈酒體分別入橡木桶和不銹鋼罐體中，在16 ℃左右的環(huán)境中進(jìn)行陳釀，陳釀1年后取樣測定，對(duì)比分析。

1.3.2 干化葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)檢測

1）樣品前處理

揮發(fā)性物質(zhì)的提取采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)，取一個(gè)20.00 mL 頂空瓶，用移液槍加入10.00 mL 待分析的干化葡萄酒，將頂空瓶放入40 ℃的水浴鍋中水浴10 min，接著插入CAR/DVB/PDMS 纖維頭吸附30 min，GC 解吸 5 min，用于 GC-MS 分析[5-6]。

2）色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序：40 ℃保持 2 min，以 10 ℃/min 的升溫速度升至260 ℃，保持 10 min。載氣為He（99.999%），體積流量為3 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流進(jìn)樣，分流比為 20 ∶1。

質(zhì)譜條件為：電子電離源（electronic ionization，EI）電子能量為70 eV，燈絲電流為0.20 mA。檢測器電壓為350 V。掃描范圍為20 m/z～450 m/z，離子源溫度200 ℃，出峰時(shí)間 1.5 min。

3）定性定量分析

利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）107 標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特征，與NIST11s.lib 譜庫中標(biāo)準(zhǔn)化合物的圖譜進(jìn)行比較判別化合物類型，并根據(jù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總離子流色譜圖計(jì)算香氣化合物的百分含量。

4）主體風(fēng)味成分分析

采用ROAV 法[7]評(píng)價(jià)揮發(fā)性成分對(duì)干化葡萄酒風(fēng)味影響的大小。定義對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分為ROAVstan=100，其他組分（A）的ROAV 按下式計(jì)算：

式中：CA為各揮發(fā)性組分的相對(duì)含量，%；TA為各揮發(fā)性組分的香氣閾值，mg/kg；Cstan為對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)含量，%；Tstan為對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的香氣閾值，mg/kg。

以相對(duì)含量最大揮發(fā)性物質(zhì)ROAVstan=100[8]，計(jì)算得到其他化合物的ROAV；當(dāng)ROAV 不小于1 時(shí)，確定為揮發(fā)性物質(zhì)為干化葡萄酒的主體風(fēng)味成分；當(dāng)0.1≤ROAV≤1 時(shí)，確定為揮發(fā)物質(zhì)對(duì)干化葡萄酒總體風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)[9]。

1.3.3 干化葡萄酒氨基甲酸乙酯含量檢測

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

稱取0.10 g 氨基甲酸乙酯于100.00 mL 容量瓶中，用甲醇溶液定容，配制成1 000.00 mg/L 的儲(chǔ)備液；再移取0.50 mL 儲(chǔ)備液至50.00 mL 容量瓶中，甲醇定容，配制成10.00 mg/L 的EC 工作液。

稱取0.10 g 氨基甲酸丙酯（內(nèi)標(biāo)物）于100.00 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，配制成1 000.00 mg/L 的儲(chǔ)備液；再移取0.50 mL 儲(chǔ)備液至50.00 mL 容量瓶中，甲醇定容，配制成10.00 mg/L 的nPC 工作液。

1.3.3.2 樣品前處理

移取0.50 mL 配制好的氨基甲酸丙酯內(nèi)標(biāo)工作液于10.00 mL 容量瓶中，用酒樣定容后混勻。取10.00 mL的正己烷于固相萃取柱上活化，接著移取3.00 mL 制備好的酒樣于固相萃取柱上，流速為5 滴/min 左右，緩慢過柱使存留在小柱中的正己烷流干，靜置10 min 使酒樣充分吸附后，棄去流出液。再用2.00 mL 的正己烷洗柱，棄去流出液。最后用10.00 mL 二氯甲烷洗脫，并用氮吹儀專用瓶收集洗脫液，直至洗脫液流干，將收集液用氮吹儀30 ℃下氮吹至1.00 mL，轉(zhuǎn)移至色譜樣品瓶，待進(jìn)樣分析[10]。

1.3.3.3 色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：色譜柱為DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），升溫程序：60 ℃保持 5 min，以4 ℃/min 的升溫速度升至150 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 的升溫速度升至200 ℃，保持2 min。載氣為He（99.999%），體積流量為 3 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件為：電子電離源（electronic ionization，EI）電子能量為70 eV，燈絲電流為0.20 mA。檢測器電壓為350 V。掃描范圍為20 m/z～450 m/z，離子源溫度200 ℃。

1.3.3.4 定性定量分析

利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所107 標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用EC 工作液分別用二氯甲烷制成 1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/L 濃度的 EC 溶液，每一份EC 溶液中加入濃度為10.00 mg/mL 的nPC 0.75 mL，以 EC 濃度為橫坐標(biāo)，EC 和 nPC 的峰面積比值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將處理好的試樣加入內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣分析的結(jié)果，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（2）計(jì)算出試樣中EC 含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同陳釀方式處理對(duì)干化葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的影響

2.1.1 不同處理的干化葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS 分析總離子流色譜圖

干化葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS 分析總離子流色譜圖見圖1。

圖1 不同處理的干化葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS 分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of aroma compounds of dry wine under different treatments analysis by GC-MS

2.1.2 干化葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)分析

兩種陳釀方式下干化葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)成分及相對(duì)含量見表1。

表1 兩種陳釀方式下干化葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)成分及相對(duì)含量Table 1 The components and relative contents of volatile matters in dry wine under two vinification methods

由表1 可以得出，兩種方式下陳釀的干化葡萄酒中共同擁有的揮發(fā)性物質(zhì)16 種。橡木桶陳釀后的干化葡萄酒中有32 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中，庚酸乙酯、2-甲基戊酸甲酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、酞酸二甲酯等，構(gòu)成了干化葡萄酒的菠蘿、梨、桔子、香蕉、椰子、葡萄等水果香氣，使得葡萄酒的果香濃郁，口感圓潤，具有了不同的風(fēng)味和口感。不銹鋼罐釀后的干化葡萄酒中有25 種揮發(fā)性物質(zhì)，特有的十四酸乙酯、乙酸異戊酯、肉豆蔻醛、5-羥基-4-辛酮等，為干化葡萄酒提供了牛奶的乳脂和油脂氣味。這是由于不銹鋼罐比橡木桶擁有更多的空留空間，存留大量空氣，而酒中酚類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物醌可以與相應(yīng)的高級(jí)醇或者氨基酸反應(yīng)生成脂族醛類等物質(zhì)[14-16]。橡木桶比不銹鋼罐增加更多的是橡木中的物質(zhì)，在陳釀過程中，橡木中的順式橡木內(nèi)酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚、香草醛、糠醇等物質(zhì)融入酒中，其中的酚類物質(zhì)會(huì)發(fā)生改變[17]，使橡木桶所提供的杏仁氣味部分轉(zhuǎn)變成類似草藥的氣味。橡木桶陳釀下高聚單寧含量較高[18]，有利于葡萄酒粗糙感降低，橡木桶對(duì)于柔化粗糙單寧感作用優(yōu)于不銹鋼罐，使干化葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)更加復(fù)雜富有結(jié)構(gòu)感。

2.1.3 干化葡萄酒主體風(fēng)味分析

根據(jù)表1 中的部分化合物的閾值及相對(duì)含量可以得出，橡木桶和不銹鋼罐陳釀后，辛酸乙酯在兩種不同陳釀方式下相對(duì)含量最高，將辛酸乙酯的ROAV 值設(shè)為100，算出其他揮發(fā)性物質(zhì)的ROAV 值如表2所示。

表2 兩種陳釀方式下干化葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)氣味活度值Table 2 Relative odor activity value of volatile matters in dry wines under two vinification methods

續(xù)表2 兩種陳釀方式下干化葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)氣味活度值Continue table 2 Relative odor activity value of volatile matters in dry wines under two vinification methods

橡木桶陳釀方式獨(dú)有的癸醛、苯乙醛和紫羅蘭酮（ROAV＞10），主要表現(xiàn)為柑橘皮、玉簪花、松木香、紫羅蘭香的特征，有些物質(zhì)雖然含量少，但是物質(zhì)含量大小與風(fēng)味特征沒有直接的關(guān)系，有些物質(zhì)需要很高濃度才能引起嗅覺反應(yīng)，有些含量很少就可以被感知，例如，不銹鋼罐陳釀方式獨(dú)有的乙酸戊酯、肉豆蔻醛雖然含量低（10＞ROAV＞1），但香氣貢獻(xiàn)大，使酒體具有脂肪香氣。

2.2 不同陳釀方式處理對(duì)干化葡萄酒中氨基甲酸乙酯的影響

2.2.1 氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)標(biāo)法測定

由圖2 得出標(biāo)準(zhǔn)品氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的出峰時(shí)間分別在19.600 min 和22.400 min，通過標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)間來確定干化葡萄酒中的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的出峰時(shí)間。

圖2 氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子色譜圖Fig.2 SIM chromatogram of EC and nPC

2.2.2 不同處理的干化葡萄酒氨基甲酸乙酯GC-MS分析總離子色譜圖

不同處理干化葡萄酒氨基甲酸乙酯GC-MS 分析總離子流色譜圖見圖3。

圖3 不同處理的干化葡萄酒氨基甲酸乙酯GC-MS 分析總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of EC of dry wine under different treatments analysis by GC-MS

2.2.3 不同處理的干化葡萄酒中氨基甲酸乙酯分析

不同處理的干化葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量見表3。

表3 不同陳釀方式下干化葡萄酒氨基甲酸乙酯含量Table 3 The content of ethyl carbamate in dry wine under different vinification

根據(jù)表3 中數(shù)據(jù)，可以看出，不銹鋼罐陳釀方式下氨基甲酸乙酯含量高于橡木桶陳釀方式，氨基甲酸乙酯含量與前體物質(zhì)濃度、氧氣、乙醇的含量、偏堿性的陳釀環(huán)境、避光有關(guān)。在橡木桶陳釀過程中，酒體在橡木桶中是保持充盈狀態(tài)的，這就極大地降低了酒體與氧氣的接觸面積。橡木表面雖然看起來平滑，但是其內(nèi)部具有很多微小氣孔，Nevares 等[19]發(fā)現(xiàn)葡萄酒中的乙醇和水能夠通過橡木的這些氣孔到空氣中，并且橡木中的多羥基酚類與乙醇競爭發(fā)生醇解反應(yīng)；曾新安等[20]的結(jié)果表明，新鮮葡萄酒入桶后，酒中的溶解氧逐漸減少，3 個(gè)月后達(dá)到穩(wěn)定值。這就造成了干化葡萄酒在橡木桶陳釀的過程中酒精度和氧氣含量相比較不銹鋼罐陳釀要低。同時(shí)有機(jī)酸含量不斷下降[21]，陳釀環(huán)境更偏向堿性。橡木桶通常置于地窖環(huán)境中，近無光照。資料顯示，現(xiàn)如今我國只有GB 5009.223-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測定》等國家標(biāo)準(zhǔn)，尚未出臺(tái)有關(guān)于氨基甲酸乙酯在干化葡萄酒中限量的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)比國外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[22]，可以得出，橡木桶陳釀下的干化葡萄酒氨基甲酸乙酯含量更低，更加安全。

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)得出，不同陳釀方式下的干化葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)成分以及主體風(fēng)味為癸醛、苯乙醛和紫羅蘭酮提供；氨基甲酸乙酯含量方面，橡木桶優(yōu)于不銹鋼罐陳釀。

橡木桶中的干化葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)更豐富，辛酸乙酯、癸醛、紫羅蘭酮等構(gòu)成了葡萄酒的白蘭地、椰子、葡萄、香草藥、玉簪花、紫羅蘭等水果、花朵揮發(fā)性氣味，使得干化葡萄酒果香、花香濃郁，風(fēng)味獨(dú)特，口感圓潤。不銹鋼罐中干化葡萄酒中含有的十四酸乙酯、乙酸異戊酯、肉豆蔻醛提供了似于牛奶的乳脂和油脂揮發(fā)性氣味。

橡木桶的陳釀環(huán)境具有低氧、低乙醇、偏堿性、避光的特性，在一定程度上抑制了氨基甲酸乙酯的生成，在橡木桶陳釀方式下酒體中檢測到的氨基甲酸乙酯含量27.642 3 μg/L，不銹鋼罐陳釀方式下酒體中檢測到的氨基甲酸乙酯含量36.219 0 μg/L。