文/葉棣柏 沈麗宮

采用外標一點法、外標曲線法、內標一點法、內標曲線法對島津的Solution工作站進行驗證// 比較手動計算與工作站計算的差別，結果發(fā)現(xiàn)，采用一點法測定時，手動計算與工作站計算有差別，需進行修正，采用曲線法進行計算時，手動計算與工作站計算一致，可直接計算。

隨著現(xiàn)代儀器分析技術的發(fā)展，色譜法由于其準確度、精密度好，逐漸替代了傳統(tǒng)的容量分析法和光譜法，廣泛應用于食品、藥品、石油化工、生命科學等領域。色譜法除了準確度高、精密度好外，還有很多優(yōu)點，如：分離效率高；分析速度快；樣品用量少；靈敏度高；易于自動化等。色譜法的自動化主要通過色譜工作站來完成，色譜工作站是一種輔助色譜儀器采樣、收集色譜檢測器當中的電壓信號數(shù)據(jù)分析處理的工作站輔助軟件。

色譜分析中，采用計算機技術的色譜工作站普遍提高了分析結果的準確度和精密度，基本消除了人為誤差，對于分離不理想的色譜峰還可以進行優(yōu)化處理，彌補分離過程的不足。色譜工作站的自動化計算可以減輕數(shù)據(jù)分析的工作量，通過輸入標準曲線的濃度，建立數(shù)據(jù)處理的方法，當輸入樣品的體積、稱重、稀釋倍數(shù)時，就可以得到最終的結果，特別是對于批量處理，更為方便。

實驗部分

儀器與試劑

1.儀器

LC-2010高效液相色譜儀（島津公司），帶紫外檢測器；

GC-2010氣相色譜儀（島津公司），帶FID檢測器、頂空進樣器；

AL204電子天平（梅特勒公司）。

2.試劑

甲硝唑片、甲硝唑標準品；

紫草油、紫草素標準品；

維生素E、維生素E標準品；

異三十烷、環(huán)己烷、紫草素、乙醇、異丙醇、甲醇，均為色譜純。

Solution工作站的驗證

1.外標法（標準一點法）

采用甲硝唑片的含量測定進行驗證，測定方法如下：采用高效液相色譜法，C18色譜柱，以甲醇：水（20:80）為流動相，檢測波長為320 nm。取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量（約相當于甲硝唑0.25 g），置50 mL量瓶中，加50%甲醇適量，振搖使甲硝唑溶解，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取甲硝唑對照品適量，精密稱定，加流動相溶解定量稀釋制成每1 mL中約含0.25 mg的溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算，即得。

2.外標法（標準曲線法）

采用紫草油中紫草素的測定方法進行驗證，測定方法如下：采用RP-HPLC法進行測定，以C18為色譜柱，以甲醇-水（85:15）；檢測波長為516 nm。取本品0.5 g，精密加入無水乙醇10 mL，采用空氣恒溫搖床振搖提取，并設置提取溫度為40℃，提取轉速為200 r/min，提取時間為10 min，取上清液作為供試品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取紫草素標準品，配制成4 μg/mL～0 μg/mL 的一系列標準溶液，同法測定，按外標曲線法以峰面積計算，即得。

3.內標法（標準一點法）

采用維生素E的含量測定進行驗證，測定方法如下：采用氣相色譜法，HP-1色譜柱，氫火焰離子化檢測器，設置柱溫為265℃。取正三十二烷適量，加正己烷溶解并稀釋成每1 mL中含1.0 mg的溶液，作為內標溶液。另取維生素E對照品約20 mg，精密稱定，置棕色具塞瓶中，精密加內標溶液10 mL，密塞，振搖使溶解，作為對照品溶液，取1～3 μL注入氣相色譜儀，計算校正因子。取本品約20 mg，精密稱定，置棕色具塞瓶中，精密加內標溶液10 mL，密塞，振搖使溶解，作為供試品溶液，取1～3 μL注入氣相色譜儀，測定，計算，即得。

表1 甲硝唑對照品校正因子計算結果。

表2 甲硝唑片含量計算結果。

4.內標法（標準曲線法）

采用紫草素中的乙醇殘留測定進行驗證，測定方法如下：采用頂空氣相色譜法，DB-624色譜柱，氫火焰離子化檢測器，設置柱溫為50℃，設置頂空平衡溫度為70℃，保溫時間8 min，進樣時間0.04 min。取異丙醇適量，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液稀釋成每1ml中含10 mg的溶液，作為內標溶液。另取乙醇對照品適量，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液稀釋成每1 mL中含10 mg的溶液，作為對照品儲備液。取對照品儲備液 各 0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、2 mL，分別加入1 ml內標溶液，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液至10 mL，配制成濃度分別為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/ml、0.8 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液。稱取樣品0.5 g，精密稱定，加內標溶液1mL，密塞，加0.1 moL/L的氫氧化鈉溶液至10 mL，作為樣品溶液，分別測定，按標準曲線法計算，即得。

結果與分析

外標法（標準一點法）

1.校正因子的計算

按上述甲硝唑片含量測定的方法進行測定，配制兩份對照品，分別進樣5次和2次，采用外標法，設定級別數(shù)為2，校準曲線類型為直線，分別采用手動計算和工作站計算校正因子，結果見表1。

由表1可以看出，在計算校正因子時，工作站計算與手動計算結果是一致的。

2.樣品含量的計算

按上述甲硝唑片含量測定的方法進行測定，配制兩份樣品溶液，各進樣2次，分別采用手動計算和工作站計算含量，結果見表2。

由表2可以看出，采用外標一點法計算樣品含量時，手動計算和工作站計算有略微的差異，這將影響到準確的結果。

3.數(shù)據(jù)的修正

將數(shù)據(jù)處理方法另存，在新的數(shù)據(jù)處理方法中的校準曲線類型改為“手動RF（線性）”，并在組分表中輸入由第一個數(shù)據(jù)處理方法計算出來的平均校正因子，采用此方法對樣品進行重新計算，得出的含量值分別為：99.989%、100.078%、100.804%、100.868%，平均值為100.435%。由數(shù)據(jù)可以看出，采用修正后的方法進行計算，與手動計算的結果一致，數(shù)據(jù)準確。

表3 紫草素對照品線性方法擬合結果。

表4 紫草油中紫草素含量計算結果。

外標法（標準曲線法）

1.線性方法的擬合

按上述紫草油中紫草素的測定方法進行測定，配制5份對照品溶液，分別進樣1次，采用外標法，設定級別數(shù)為5，校準曲線類型為直線，以峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標，分別采用手動計算和工作站擬合線性方法，結果見表3。

表5 維生素E對照品校正因子計算結果。

表6 維生素E含量計算結果。

表7 乙醇對照品校正因子計算結果。

表8 乙醇含量計算結果。

由表3可以看出，采用手動計算和工作站計算得到的擬合曲線基本一致。

2.樣品含量的計算

按上述紫草油中紫草素的測定方法進行測定，配制兩份樣品溶液，各進樣2次，分別采用手動計算和工作站計算含量，結果見表4。

由表4可以看出，采用外標曲線點法計算樣品含量時，手動計算和工作站計算結果是一致的。

內標法（標準一點法）

1.校正因子的計算

按維生素E含量測定的方法進行測定，配制兩份對照品，分別進樣5次和2次，采用內標法，設定級別數(shù)為2，校準曲線類型為直線，分別采用手動計算和工作站計算校正因子，結果見表5。

由表5可以看出，在計算校正因子時，工作站計算與手動計算結果基本一致的。

2.樣品含量的計算

按維生素E含量測定的方法進行測定，配制兩份樣品溶液，各進樣2次，分別采用手動計算和工作站計算含量，結果見表6。

由表6可以看出，采用內標一點法計算樣品含量時，手動計算和工作站計算有略微的差異，這將影響到準確的結果。

3.數(shù)據(jù)的修正

將數(shù)據(jù)處理方法另存，在新的數(shù)據(jù)處理方法中的校準曲線類型改為“手動RF（線性）”，并在組分表中輸入由第一個數(shù)據(jù)處理方法計算出來的平均校正因子，采用此方法對樣品進行重新計算，得出的含量值分別為：100.583%、99.764%、99.303%、99.524%， 平 均 值 為99.793%。由數(shù)據(jù)可以看出，采用修正后的方法進行計算，與手動計算的結果一致，數(shù)據(jù)準確。

內標法（標準曲線法）

1.線性方法的擬合

按紫草素中乙醇的測定方法進行測定，配制6份對照品溶液，分別進樣1次，采用內標法，設定級別數(shù)為6，校準曲線類型為直線，以對照品峰面積/內標峰面積為橫坐標，對照品濃度/內標濃度為縱坐標，分別采用手動計算和工作站擬合線性方法，結果見表7。

由表7可以看出，采用手動計算和工作站計算得到的擬合曲線基本一致。

2.樣品含量的計算

按維紫草素中的乙醇殘留測定方法進行測定，配制兩份樣品溶液，各進樣2次，分別采用手動計算和工作站計算含量，結果見表8。

由表8可以看出，采用內標曲線點法計算樣品含量時，手動計算和工作站計算結果是一致的。

討論

標準一點法

使用外標一點法及內標一點法進行計算時，采用平均校正因子進行計算樣品含量，為消除偶然誤差，一般要稱取對照品兩份，其中一份對照品溶液進樣5次，考察儀器的進樣重復性，另一份對照品進樣2次，以7針的校正因子計算平均值，計算樣品的含量。而儀器在計算時均采用斜率法進行測定，按7針進行線性擬合后，計算斜率和截距后進行計算，因此有偏差。無論是外標一點法還是內標一點法，對計算方法均需進行校正，在得到平均校正因子后，改為手動校正因子進行計算。

標準曲線法

使用外標曲線法和內標曲線法進行計算時，采用斜率法進行計算含量，與工作站計算方法一致，因此可直接計算。

結論

采用單點校正法時，需采用兩個數(shù)據(jù)處理方法，先求出平均校正因子，再選擇手動RF值進行計算。采用標準曲線法時，可直接采用1個數(shù)據(jù)處理方法即可。