周 仁，鄭鴻塵，李文詠，王夢(mèng)瑩，王斯悅，李 楠，李 靜，周治波，吳 濤，朱洪平△

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京 100191； 2.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，口腔頜面外科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；3.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院兒童口腔科，北京 100081)

非綜合征型唇腭裂(non-syndromic oral clefts, NSOCs)是我國常見的出生缺陷之一，其患病率僅次于美洲印第安人和日本人[1]，患病率每1 000名活產(chǎn)兒約為1.39～1.46[2]。NSOC根據(jù)累及解剖部位不同可分為3種亞型，即單純腭裂(non-syndromic cleft palate only, NSCPO)、單純唇裂(non-syndromic cleft lip only, NSCLO)和唇裂合并腭裂(non-syndromic cleft lip and palate, NSCLP)；后兩者由于流行病學(xué)特征及胚胎發(fā)育起源特征的相似性被認(rèn)為具有相同的病因背景，在該領(lǐng)域病因?qū)W研究中通常合并為一類，稱為非綜合征型唇裂合并或不合并腭裂(cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)。NSCL/P是一種復(fù)雜性疾病，其遺傳病因探索一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來廣泛開展的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)已發(fā)現(xiàn)數(shù)十個(gè)影響NSOC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的基因或區(qū)域[3-6]，然而這些基因或區(qū)域僅能解釋NSOC遺傳度的約20%[7]，提示仍有遺傳危險(xiǎn)因素尚未被發(fā)現(xiàn)。

由于GWAS的理論基礎(chǔ)是常見復(fù)雜疾病的遺傳危險(xiǎn)因素來源于人群中弱勢(shì)等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)大于等于5%的常見遺傳變異[8-9]，該方法難以探索MAF小于5%的罕見遺傳變異或低頻遺傳變異，而MAF小于5%的罕見遺傳變異或低頻遺傳變異可能具有更強(qiáng)的致病效應(yīng)，對(duì)遺傳度的貢獻(xiàn)更大[10]。因此，搜尋致病性罕見變異是后GWAS時(shí)代非綜合征型唇腭裂遺傳病因?qū)W研究的焦點(diǎn)。二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)則為搜尋罕見致病位點(diǎn)提供了高效可靠的方法。該技術(shù)不僅能檢測(cè)常見變異，更重要的是可以彌補(bǔ)GWAS難以覆蓋到的罕見變異。根據(jù)測(cè)序覆蓋范圍不同，二代測(cè)序可以分為全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing，WES)和目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，其中WES覆蓋整個(gè)外顯子組，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)的遺傳變異更有利于對(duì)結(jié)果的生物學(xué)功能進(jìn)行合理的解釋，因此，全外顯子組測(cè)序在復(fù)雜疾病的遺傳病因探索方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。此外，親源效應(yīng)也是尚未被解釋的遺傳度的可能來源之一，由于親源效應(yīng)是指親本來源染色體上的等位基因出現(xiàn)差異性表達(dá)，即相同等位基因?qū)膊★L(fēng)險(xiǎn)的影響因其親本來源不同而不同，探索親源效應(yīng)不僅能加深對(duì)該疾病遺傳病因的理解，還能為今后的唇腭裂遺傳咨詢、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作提供科學(xué)依據(jù)。

SPRY基因家族包含4個(gè)基因，分別為SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4，且位于不同的染色體。SPRY基因編碼的蛋白質(zhì)能夠參與和調(diào)節(jié)多個(gè)涉及人體生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)通路的正常表達(dá)，如RTK(receptor tyrosine kinase)信號(hào)通路和FGF(fibroblast growth factors)信號(hào)通路[11-12]，其中，F(xiàn)GF信號(hào)通路能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和胚胎的形態(tài)學(xué)特征，曾被報(bào)道與唇腭裂的發(fā)生有緊密聯(lián)系[13]。Ludwig等[14]在一篇Meta分析首次報(bào)道了SPRY2附近區(qū)域rs8001641的變異與NSCLP關(guān)聯(lián)；隨后Jia等[15]和Moreno Uribe等[16]在歐洲人群中成功復(fù)制了rs8001641位點(diǎn)的變異與NSCLP的關(guān)聯(lián)。在中國人群中，Yu等[6]利用漢族人群3 379名NSCLP病例和8 593名對(duì)照者發(fā)現(xiàn)了SPRY2基因(rs9545308)與NSCLP的關(guān)聯(lián)，并報(bào)道了該家族另一基因SPRY1基因的rs908822位點(diǎn)變異與NSCLP的關(guān)聯(lián)，提示SPRY基因家族可能在中國人群NSCL/P發(fā)病過程中發(fā)揮作用。然而，目前在中國人群NSCL/P中對(duì)SPRY基因家族的分析多利用GWAS數(shù)據(jù)，對(duì)該基因家族中的罕見變異探索較少見。

本研究基于病例-雙親設(shè)計(jì)，以2016—2018年于北京大學(xué)口腔醫(yī)院募集的 183個(gè)中國人群非綜合征型唇裂合并或不合并腭裂核心家系(549人)為研究對(duì)象。利用其二代測(cè)序數(shù)據(jù)中的SPRY基因家族相關(guān)信息，展開單核苷酸多態(tài)性(尤其是罕見變異)和親源效應(yīng)分析，探索SPRY基因家族中的單核苷酸多態(tài)性及親源效應(yīng)與中國人群非綜合征型唇腭裂發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究開始前獲得北京大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(IRB00001052-15081)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，未成年人由其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

本研究2016—2018年于北京大學(xué)口腔醫(yī)院募集的183個(gè)中國NSCL/P核心家系(共549人)為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)非綜合征型唇腭裂患兒；(2)患兒及其父母自愿參加本次研究并且簽署書面知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患兒父母中僅一方可以參加本次研究。

由臨床專家和遺傳學(xué)專家共同確診病例及疾病亞型，所有病例通過臨床檢查排除綜合征型唇腭裂。所募集的183名NSCL/P患者中包含114名男性，69名女性。本研究采用二階段設(shè)計(jì)，于第一階段對(duì)24個(gè)具有陽性家族史的NSCL/P核心家系進(jìn)行全外顯子測(cè)序階段，第二階段在159個(gè)NSCL/P獨(dú)立樣本中對(duì)第一階段陽性信號(hào)進(jìn)行驗(yàn)證。兩階段中NSCL/P患者的性別分布見表1。

表1 中國人群183個(gè)NSCL/P患者的性別分布情況Table 1 The sex distribution of 183 NSCL/P cases in Chinese populations

1.2 數(shù)據(jù)收集及基因型檢測(cè)

募集現(xiàn)場(chǎng)由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員通過面對(duì)面的問卷調(diào)查收集患者及父母的基本信息、環(huán)境暴露等情況，并根據(jù)臨床體格檢查獲取患者的生長(zhǎng)發(fā)育情況。對(duì)患兒及其父母采集每人4 mL靜脈血，采用鹽析法從血細(xì)胞中提取DNA樣本進(jìn)行基因型檢測(cè)。第一階段的全外顯子組測(cè)序由武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司完成。使用NimbleGen SeqCap EZ V3(64M)平臺(tái)進(jìn)行外顯子組捕獲，使用Illumina Hiseq4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。根據(jù)測(cè)序深度(剔除測(cè)序深度小于6或大于500的位點(diǎn))、基于樣本的缺失率等指標(biāo)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，得到一階段分析的遺傳變異位點(diǎn)。第二階段對(duì)驗(yàn)證位點(diǎn)的檢測(cè)采用KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)技術(shù)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟按照LGC公司的KASP操作指南(www.lgcgenomics.com)進(jìn)行。對(duì)二階段驗(yàn)證位點(diǎn)的質(zhì)量控制包括：(1)剔除分型缺失率>10%的SNP位點(diǎn)；(2)在父母親人群中計(jì)算每一個(gè)SNP位點(diǎn)的MAF，剔除MAF<0.1%的SNP位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所基于的二代測(cè)序研究采用二階段設(shè)計(jì)，因此數(shù)據(jù)分析分為相應(yīng)的兩部分：第一階段對(duì)SPRY基因的外顯子組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行遺傳變異的注釋、功能預(yù)測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析包括單位點(diǎn)分析和多位點(diǎn)分析，結(jié)合以上結(jié)果挑選可能的致病位點(diǎn)作為二階段驗(yàn)證位點(diǎn)；第二階段對(duì)一階段發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)進(jìn)行單位點(diǎn)分析和親源效應(yīng)分析。

1.3.1一階段數(shù)據(jù)分析

1.3.1.1遺傳變異的注釋及功能預(yù)測(cè) 本研究采用SnpEff(http: //snpeff.sourceforge.net/SnpEff_manual.html)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果做注釋及功能預(yù)測(cè)，包括變異所在區(qū)域,是否導(dǎo)致蛋白編碼和氨基酸改變,Polyphen2、SIFT、CADD(combined annotation dependent depletion)分值等功能預(yù)測(cè)指標(biāo)。Polyphen2用于評(píng)價(jià)特定位點(diǎn)變異引起的氨基酸變化對(duì)人體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的影響，其取值范圍為0～1，Polyphen2的取值越大表示該位點(diǎn)變異帶來的氨基酸變化對(duì)人體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的影響越大。根據(jù)Polyphen2取值大小可將變異分為良性(0～0.446)、可能有危害(0.447～0.908)、很可能有危害(0.909～1)3類。SIFT用于評(píng)價(jià)某個(gè)氨基酸變化對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響,通過在基因組中尋找與目標(biāo)位點(diǎn)附近序列相似的序列，與其進(jìn)行比對(duì)并計(jì)算發(fā)生堿基替換的概率，若位點(diǎn)發(fā)生堿基替換的概率小于0.05，則認(rèn)為該位點(diǎn)是有害的。CADD分值也叫做C-scores，該指標(biāo)將多個(gè)注釋及功能預(yù)測(cè)指標(biāo)整合為一個(gè)指標(biāo)，可定量評(píng)價(jià)某位點(diǎn)變異帶來的功能學(xué)影響以及是疾病致病位點(diǎn)的可能性大小,若某位點(diǎn)的分值大于或等于10，則認(rèn)為該位點(diǎn)可能為疾病的致病位點(diǎn)。

1.3.1.2單位點(diǎn)分析 采用TDT方法進(jìn)行單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析，其無效假設(shè)是雜合子父母?jìng)鬟f任意一等位基因給患病子女的概率為50%，若研究人群中傳遞情況與無效假設(shè)不符，表明該等位基因與疾病存在關(guān)聯(lián)，提示該遺傳標(biāo)記位點(diǎn)與潛在致病位點(diǎn)之間存在連鎖或二者處于連鎖不平衡。由PLINK (v1.07, http: //pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)軟件完成。

1.3.1.3多位點(diǎn)分析 采用以家系為基礎(chǔ)的序列核心關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)(family-based sequence kernel association test)方法,將單個(gè)基因內(nèi)多個(gè)遺傳位點(diǎn)的效應(yīng)進(jìn)行整合, 以基因或區(qū)域?yàn)閱挝惶峁┬?yīng)值，從而檢驗(yàn)位點(diǎn)與表型之間的關(guān)聯(lián)，此分析由R軟件的famSKAT-RC包完成，該計(jì)算包在整合多個(gè)遺傳位點(diǎn)的效應(yīng)值時(shí)可同時(shí)納入常見變異及罕見變異。

根據(jù)以上分析中遺傳變異的注釋結(jié)果、功能預(yù)測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，選取滿足以下任意一種情況的位點(diǎn)進(jìn)入驗(yàn)證階段：(1) Polyphen2≥0.909或SIFT≤0.05或CADD≥10的位點(diǎn)；(2) TDT中P值小于0.05的位點(diǎn)；(3)famSKAT中P值小于0.05的基因上的位點(diǎn)。

1.3.2二階段數(shù)據(jù)分析

對(duì)納入驗(yàn)證階段的位點(diǎn)進(jìn)行如下分析；本階段分析采用Bonferroni法進(jìn)行多重檢驗(yàn)矯正，矯正后顯著性水平P=0.05/3=0.017。

1.3.2.1單位點(diǎn)分析 采用TDT方法進(jìn)行單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析，由PLINK (v1.07, http: //pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)軟件完成。

1.3.2.2親源效應(yīng)分析 本研究采用Z檢驗(yàn)分析親源效應(yīng)。原理為分別考慮父親和母親向子代傳遞中的傳遞不平衡情況，得到在父親-子代、母親-子代兩種傳遞方向中某等位基因傳遞與未傳遞的比值比，通過比較母親和父親分別向子代傳遞過程中的比值比是否存在差異，以檢驗(yàn)是否存在親源效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)分析由PLINK(v1.07, http: //pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 一階段分析結(jié)果

本研究按照所制定的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)一階段24個(gè)NSCL/P核心家系全外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)中位于SPRY基因家族中的24個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)量控制，共22個(gè)位點(diǎn)納入分析。

位點(diǎn)注釋結(jié)果顯示本研究納入的22個(gè)位點(diǎn)中，11個(gè)位于3′端非翻譯區(qū)、1個(gè)位于5′端非翻譯區(qū)、5個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)域、3個(gè)位于基因下游區(qū)、2個(gè)為錯(cuò)義突變位點(diǎn)。錯(cuò)義突變的位點(diǎn)有位于SPRY1基因rs1298215244位點(diǎn)(c.920T>C)，其SIFT值為0.013，Polyphen2值為0.844，CADD值為4.46；位于SPRY2基因的rs504122位點(diǎn)(c.316C>T突變)， 其SIFT值為0.097，Polyphen2值為0.001，CADD值為0.16。利用TDT在22個(gè)位點(diǎn)中進(jìn)行單位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示22個(gè)位點(diǎn)均達(dá)不到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平(P<0.05)， 其中P值最小的位點(diǎn)為SPRY1基因上的rs300574(P=0.083)，P值最小的前五位位點(diǎn)的TDT檢驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 中國人群24個(gè)NSCL/P核心家系SPRY基因家族中單位點(diǎn)的傳遞不平衡檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Transmission disequilibrium tests of SNPs in the SPRY gene family among 24 Chinese NSCL/P trios

采用以家系為基礎(chǔ)的序列核心關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)以基因?yàn)閱挝贿M(jìn)行多位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。納入分析的位點(diǎn)中有5個(gè)位于SPRY1基因，5個(gè)位于SPRY2基因，12個(gè)位于SPRY4基因。將這些位點(diǎn)以基因?yàn)閱挝贿M(jìn)行組合，分別檢驗(yàn)SPRY1、SPRY2、SPRY4基因與NSCL/P發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。當(dāng)phi分別取0、0.2、0.5、0.8、1時(shí)，SPRY基因與NSCL/P的關(guān)聯(lián)均不能達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平(P<0.05),其中參數(shù)phi為罕見變異對(duì)疾病遺傳度的貢獻(xiàn)程度，當(dāng)phi取1時(shí)表明該疾病遺傳度全部來源于罕見變異，當(dāng)phi取0時(shí)表明該疾病遺傳度全部來源于常見變異。以基因?yàn)閱挝坏亩辔稽c(diǎn)分析結(jié)果見表3。

表3 中國人群24個(gè)NSCL/P核心家系中SPRY基因的以家系為基礎(chǔ)的序列核心關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)分析結(jié)果Table 3 The famSKAT analysis of SPRY genes among 24 Chinese NSCL/P trios

2.2 二階段驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)一階段測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果及驗(yàn)證位點(diǎn)的納入標(biāo)準(zhǔn)，并另外納入一個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，納入二階段驗(yàn)證的位點(diǎn)有兩個(gè)，分別為rs1298215244(SPRY1)和rs504122(SPRY2)。對(duì)二階段159個(gè)NSCL/P核心家系中這兩個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行單位點(diǎn)分析、親源效應(yīng)分析。

在159個(gè)NSCL/P驗(yàn)證家系中進(jìn)行TDT檢驗(yàn)，并利用Bonferroni法對(duì)結(jié)果進(jìn)行多重檢驗(yàn)矯正。由于納入驗(yàn)證的rs504122(SPRY2)位點(diǎn)在中國人群中存在不同堿基的變異，分別為G>C和G>T，因此TDT檢驗(yàn)次數(shù)為3次，Bonferroni多重檢驗(yàn)校正后的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平為P=0.05/3=0.017，結(jié)果顯示驗(yàn)證位點(diǎn)與NSCL/P發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且達(dá)到經(jīng)Bonferroni多重檢驗(yàn)校正后的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平(P=0.05/3=0.017，表4)。

表4 中國人群159個(gè)NSCL/P核心家系中驗(yàn)證位點(diǎn)的傳遞不平衡檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Transmission disequilibrium tests of potential signals in the SPRY gene family among 159 Chinese NSCL/P trios

MAF, minor allele frequency;OR, odds ratio.

在二階段159個(gè)NSCL/P驗(yàn)證家系中對(duì)驗(yàn)證位點(diǎn)進(jìn)行親源效應(yīng)分析，以探索遺傳變異對(duì)疾病的作用是否受其親代來源的影響，同樣采用Bonferroni法對(duì)結(jié)果進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。結(jié)果顯示位于SPRY1基因的rs1298215244其親源效應(yīng)與NSCL/P的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但經(jīng)Bonferonni校正后不能達(dá)到顯著性水平(P=0.05/3=0.017)。驗(yàn)證位點(diǎn)親源效應(yīng)分析的檢驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 中國人群159個(gè)NSCL/P核心家系中驗(yàn)證位點(diǎn)的親源效應(yīng)分析結(jié)果Table 5 Analyses of parent-of-origin effects for potential signals in the SPRY gene family among 159 Chinese NSCL/P trios

3 討論

本研究基于病例-雙親核心家系設(shè)計(jì)，探索SPRY基因家族中單核苷酸多態(tài)性及親源效應(yīng)與中國人群NSCL/P發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)SPRY基因家族中rs1298215244的T>C變異、rs504122的G>C變異兩種常見變異和位于rs504122的G>T罕見變異與NSCL/P存在關(guān)聯(lián)，未發(fā)現(xiàn)該基因家族內(nèi)SNP位點(diǎn)具有親源效應(yīng)。

本研究所發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)均位于SPRY基因的外顯子區(qū)域，且位點(diǎn)變異類型為錯(cuò)義突變，說明該遺傳變異可改變氨基酸編碼，進(jìn)而可能影響SPRY蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。其中rs504122位點(diǎn)的突變與人體內(nèi)多種組織的啟動(dòng)子組蛋白標(biāo)記、增強(qiáng)子組蛋白標(biāo)記及DNA剪切酶相關(guān)，且該位點(diǎn)的變異可能影響與KAP1蛋白的結(jié)合[17]，該蛋白質(zhì)已被發(fā)現(xiàn)與胚胎干細(xì)胞的分化過程存在緊密聯(lián)系[18]。由于SPRY蛋白質(zhì)為酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK)信號(hào)通路的拮抗劑，在多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19-21]；SPRY基因編碼的蛋白質(zhì)也是纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子[11]，因此本研究所發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)可能通過影響SPRY蛋白質(zhì)對(duì)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的生物學(xué)過程，進(jìn)而影響胚胎的頜面部發(fā)育。此外，曾有動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)的SPRY1和SPRY2基因的表達(dá)異常可影響胚胎的頜面部發(fā)育過程，導(dǎo)致面部裂、腭裂、鼻額骨無法形成等頜面部缺陷[22-24]。上述動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)也為本研究在SPRY基因家族外顯子區(qū)域所發(fā)現(xiàn)的遺傳變異位點(diǎn)提供了一定程度的支持，表明本研究所發(fā)現(xiàn)的變異可能通過影響SPRY基因的調(diào)控功能影響胚胎頜面部發(fā)育。

既往數(shù)項(xiàng)人群研究曾對(duì)SPRY基因展開非綜合征型唇腭裂的遺傳病因探索,Lugwig等[14]、Jia等[15]和Moreno Uribe等[16]曾先后在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)并復(fù)制了位于SPRY2基因的rs8001641與非綜合征型唇腭裂的關(guān)聯(lián)，SPRY1與SPRY2在中國人群中也曾被發(fā)現(xiàn)陽性信號(hào)[6]。在該基因家族中罕見遺傳變異的探索方面，Jia等[15]利用病例對(duì)照研究在病例組中發(fā)現(xiàn)了13q31.1區(qū)域的4個(gè)罕見變異，雖然其與唇腭裂的關(guān)聯(lián)沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平，但這些罕見變異在對(duì)照組人群中均不存在，提示SPRY2基因中的罕見變異可能是該疾病的病因來源之一。上述研究所發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)多位于基因的內(nèi)含子或基因間區(qū)域，較難對(duì)陽性信號(hào)進(jìn)行生物學(xué)功能解釋。盡管本研究發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與既往發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)不重合且不存在強(qiáng)連鎖不平衡，但本研究的陽性信號(hào)位于外顯子編碼區(qū)，提示其可能通過影響蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)參與發(fā)病。

本研究未發(fā)現(xiàn)與NSCL/P具有關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)具有親源效應(yīng)，提示陽性位點(diǎn)對(duì)疾病的影響程度不受等位基因的來源(父親或母親)所影響。親源效應(yīng)是指依靠單親傳遞某些遺傳學(xué)形狀，親本來源染色體上的等位基因出現(xiàn)差異性表達(dá)，即兩個(gè)親本等位基因中一方表達(dá)，另一方沉默的現(xiàn)象[25]。親源效應(yīng)分析的本質(zhì)是探索同一等位基因?qū)膊“l(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的效應(yīng)強(qiáng)度是否受該基因來源(來源于父親或母親)的影響。由于核心家系可收集患兒及其父母雙方的遺傳信息，核心家系研究是在親源效應(yīng)分析方面相對(duì)于病例對(duì)照研究具有研究設(shè)計(jì)上的天然優(yōu)勢(shì)。本研究未能發(fā)現(xiàn)SPRY基因的親源效應(yīng)與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，可能與樣本量有限或親源效應(yīng)強(qiáng)度較弱有關(guān)，因此有關(guān)SPRY基因是否能通過親源效應(yīng)影響NSCL/P的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍有待后續(xù)研究的進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究以183個(gè)中國人群NSCL/P核心家系的二代測(cè)序數(shù)據(jù)中SPRY基因家族相關(guān)信息展開分析，可以進(jìn)一步探索既往GWAS無法覆蓋的罕見變異與NSCL/P的關(guān)系。研究基于病例-雙親核心家系設(shè)計(jì)，可以較好地控制人群分層所帶來的混雜，并可借助父母及子代的遺傳信息對(duì)基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，同時(shí)為親源效應(yīng)分析提供可能。本研究所基于的測(cè)序研究采用二階段設(shè)計(jì)，可提高研究效率；然而由于一階段樣本量較少，可能影響本研究發(fā)現(xiàn)罕見變異的功效；第一階段未采用嚴(yán)格的多重檢驗(yàn)校正以避免遺漏潛在致病位點(diǎn)，因而第一階段結(jié)果存在假陽性的可能，但本研究在第二階段采用了更大樣本量的獨(dú)立樣本對(duì)第一階段結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)陽性閾值進(jìn)行了多重檢驗(yàn)校正，可進(jìn)一步篩選陽性信號(hào)，減少了被成功驗(yàn)證的位點(diǎn)中出現(xiàn)假陽性的可能。此外，測(cè)序數(shù)據(jù)中位于SPRY基因區(qū)域的位點(diǎn)數(shù)目較少，說明測(cè)序數(shù)據(jù)在該目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的覆蓋率較低，可能遺漏一些與NSCL/P發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。本研究對(duì)NSCL/P亞型進(jìn)行遺傳病因探索，由于不同亞型其病因來源存在一定差異，還可依據(jù)是否患有腭裂、是否合并缺牙等對(duì)該亞型進(jìn)行更加細(xì)致的劃分，有助于提高研究效率。未來可在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上，針對(duì)SPRY基因家族進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，提高該區(qū)域的位點(diǎn)覆蓋率，并對(duì)疾病亞型進(jìn)行劃分，更加全面、細(xì)致地探索SPRY基因家族中罕見變異與中國人群NSCL/P的關(guān)聯(lián)，為未來進(jìn)一步開展風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、遺傳咨詢及產(chǎn)前篩檢、制定有效的預(yù)防策略措施提供科學(xué)依據(jù)。