日糧中添加不同水平杜仲葉對牦牛瘤胃液體外發(fā)酵的影響

嚴欣茹， 楊尚霖， 郭春華*， 柏 雪， 張正帆， 萬國英

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，動物科學(xué)國家民委重點實驗室，四川成都 610041；2.貴州五新農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司，貴州銅仁 554300）

杜仲（Eucommia ulmoides oliver）是杜仲科杜仲屬的多年生落葉喬木植物，是我國珍貴傳統(tǒng)中藥材。研究表明，杜仲中含有包括綠原酸、黃酮類、杜仲苷、鞣質(zhì)、多糖、氨基酸在內(nèi)的多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分（唐瑤等，2014），具有增強免疫力、降低體內(nèi)脂肪、平衡血壓、抗菌消炎、抗應(yīng)激、健筋骨、清熱利尿、抗衰老、抗氧化等多種藥理作用（趙瀅等，2014）。近年來，由于飼料中添加抗生素和化學(xué)藥物對畜禽產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生極大的負面影響，杜仲作為抗生素代替物走進人們的視野。研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加杜仲，能夠改善動物機體免疫系統(tǒng)的功能，提高機體防御能力，顯著促進動物生長，提高飼料利用率，改善肉質(zhì)，提高風(fēng)味。目前，杜仲作為飼料添加劑，已經(jīng)應(yīng)用于豬、家禽、魚類及部分反芻動物飼料中（梁松瓊等，2015）。

近年來，為提高牦牛生產(chǎn)效率，研究出放牧加補飼或者舍飼育肥模式（陳光吉等，2015），而杜仲在牦牛飼料中應(yīng)用效果鮮見報道。本試驗通過體外模擬瘤胃內(nèi)環(huán)境，進行體外產(chǎn)氣試驗，研究杜仲對牦牛瘤胃發(fā)酵及養(yǎng)分降解率的影響，為杜仲作為飼料添加劑在牦牛飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 杜仲葉由貴州五新農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司提供，取材于貴州省銅仁市。杜仲葉置于65℃烘箱烘干，粉碎后過40目篩，用塑料自封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

從西南民族大學(xué)青藏高原牦牛試驗基地 （位于阿壩州紅原縣），選取3頭體重相近成年健康牦牛，飼喂前用真空泵抽取瘤胃內(nèi)容物，混合后用4層紗布過濾，封裝后迅速帶回實驗室備用。

1.2 試驗設(shè)計 采用單因素試驗設(shè)計，分為6個處理組，基礎(chǔ)日糧精粗比為50∶50，分別用0%（對照組）、1%、2%、3%、4%、5%的杜仲葉替代基礎(chǔ)日糧中的粗料，每個處理組設(shè)4個重復(fù)。試驗日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）%

1.3 體外發(fā)酵 培養(yǎng)液的配制參照Menke（1988）的方法，人工唾液配制見表2。加入1%刃天青數(shù)滴，持續(xù)通入CO2去除氧氣直至緩沖液由紅色變成無色為止，現(xiàn)配現(xiàn)用。然后將瘤胃液與人工唾液按1∶2體積比配制成體外混合培養(yǎng)液。將配制好的混合培養(yǎng)液持續(xù)通入CO2氣體并置于39.5℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱備用。體外培養(yǎng)裝置為100 mL具塞塑料注射器，內(nèi)有刻度，注射器前端連接一條5 cm的硅膠軟管，并用止水夾將軟管夾緊。試驗前分別準確稱取1000 mg底物置于注射器底部，然后吸入50 mL混合培養(yǎng)液，輕微震蕩搖勻并排出氣泡后置于（39±0.5）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每個處理四個重復(fù)，并設(shè)置一個空白對照管（僅含有混合培養(yǎng)液）以減少系統(tǒng)誤差。 分別記錄 2、4、6、9、12、24、36、48、72 h各時間點的產(chǎn)氣量，每間隔2 h輕微搖勻注射器 （劇烈發(fā)酵后會出現(xiàn)固液相分離的現(xiàn)象），每次記錄產(chǎn)氣量后推動活塞至初始刻度。待培養(yǎng)72 h后，將塑料注射器取出，放入冰水浴中使發(fā)酵停止。

表2 人工唾液配制

1.4 指標測定及方法

1.4.1 發(fā)酵指標測定 體外培養(yǎng)72 h后立即用冰水浴終止發(fā)酵后，將培養(yǎng)液無損的轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，立即用PHB-5型便攜式pH計，測定培養(yǎng)液的pH；NH3-N的測定參考馮宗慈等（2010）的比色法；MCP濃度的測定參照Makkar等（1982）的方法。

1.4.2 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定 飼料原料和培養(yǎng)液固相殘留物中CP、DM、Ash、ADF和NDF含量的測定均參照張麗英（2003）的方法。 DMD、CPD、ADFD和NDFD的計算參照馬艷艷等（2014）的方法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及方法 產(chǎn)氣量/mL=該段時間內(nèi)培養(yǎng)管產(chǎn)氣量-空白管產(chǎn)氣量。產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)的計算參照France等 （2000）提出的計算模型：GP=b×（1-e-c（t-L）），使用 SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件中非線性回歸程序進行產(chǎn)氣參數(shù)估計。其中GP表示培養(yǎng)t時間點的產(chǎn)氣量，mL；e為自然對數(shù)；t為培養(yǎng)時間，h；b為潛在最大產(chǎn)氣量，mL/g DM；c為產(chǎn)氣速率，h；L為產(chǎn)氣前的延滯時間，h。添加杜仲葉的處理組與對照組進行單一自由度的方差分析。以P＜0.05為差異顯著性判斷標準，結(jié)果用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉營養(yǎng)成分 實驗室測定的杜仲常規(guī)營養(yǎng)成分中，DM含量為92.82%，干物質(zhì)基礎(chǔ)上，CP含量為12.15%，EE含量為4.20%，Ash含量為9.71%，NDF含量為45.31%，ADF含量為33.07%。

2.2 體外發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)特點 產(chǎn)氣參數(shù)如表3，體外發(fā)酵72 h后，各組總產(chǎn)氣量（GP）、最大潛在產(chǎn)氣量（b）、產(chǎn)氣速率（c）及產(chǎn)氣前停滯時間（L）差異均不顯著（P＞0.05）。由圖1體外產(chǎn)氣曲線可以看出，0～24 h產(chǎn)氣速率逐漸變大，24 h后速率逐漸放緩，各組總體趨勢相同，72 h總產(chǎn)氣量均接近或達到最大潛在產(chǎn)氣量。

表3 不同添加水平72 h產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)

圖1 72 h體外產(chǎn)氣曲線

2.3 體外發(fā)酵DMD、CPD、NDFD和 ADFD的特點 由表4可知，不同添加水平的杜仲葉對DMD、CPD、NDFD和 ADFD有極顯著的影響（P＜0.01）。本試驗中，隨杜仲葉添加水平的提高，日糧中DMD、CPD、ADFD和NDFD呈二次曲線變化（P＜0.01）。如圖2、圖3所示，與對照組相比，1%組、2%組、3%組、4%組、5%組的 DMD分別 提 高 8.85% 、9.15% 、11.90% 、15.47% 、14.55%，CPD分別提高 2.20%、4.11%、8.59%、10.72%、7.27%，NDFD分別提高 5.11%、7.11%、9.50% 、13.31% 、6.83% ，ADFD 分 別 提 高11.96%、15.17%、16.57%、16.57、18.60%、11.25%。在添加量為4%時達到最大值，添加量提高到5%時，日糧中DMD、CPD、ADFD和NDFD顯著降低（P ＜ 0.05）。

表4 不同添加水平72 h發(fā)酵后DMD、CPD、NDFD 和 ADFD

圖2 不同添加水平72 h發(fā)酵后DMD和CPD

圖3 不同添加水平72 h發(fā)酵后NDFD和ADFD

2.4 體外發(fā)酵pH、NH3-N和MCP濃度特點由表5可知，各試驗組之間的pH差異均不顯著（P ＞ 0.05），變異范圍在 6.33～ 6.37，均屬于瘤胃微生物生長的正常范圍；各試驗組的NH3-N和MCP濃度差異極顯著（P＜0.01），如圖4所示，與對照組相比，1%組、2%組、3%組、4%組、5%組的NH3-N濃度分別降低 4.05%、4.73%、8.68%、11.03%、12.99%，MCP濃度分別提高 104.55%、204.55%、222.73%、236.36%、236.36%。 NH3-N 濃度隨杜仲葉添加水平的提高呈線性下降，而MCP濃度隨杜仲葉添加水平的提高呈二次曲線變化，添加量為1%～3%時MCP濃度顯著增加，當添加量為3%以上時，MCP濃度的增加速率變緩，達到一個平臺。

表5 不同添加水平72 h發(fā)酵后pH、NH3-N濃度和MCP濃度

圖4 不同添加水平72 h發(fā)酵NH3-N和MCP濃度

3 討論

3.1 添加杜仲葉對牦牛瘤胃液體外產(chǎn)氣量的影響 產(chǎn)氣量是綜合評價日糧發(fā)酵程度的重要指標，不僅能夠體現(xiàn)瘤胃微生物的活躍程度，也能反映日糧蛋白質(zhì)營養(yǎng)水平，產(chǎn)氣量的大小與日糧中有機物的降解程度呈正相關(guān) （黃雅莉，2014）。本試驗中，各組發(fā)酵72 h后的總產(chǎn)氣量差異不顯著，但是各試驗組的總產(chǎn)氣量均值呈先增加后降低趨勢，4%組的產(chǎn)氣量達到最大值，與本試驗中DMD趨勢基本一致，各組差異不顯著，可能是因為本試驗采用的體外發(fā)酵裝置，只是模擬瘤胃環(huán)境，與真實的瘤胃環(huán)境還存在一定差異，所以不能顯著體現(xiàn)各組產(chǎn)氣量的差異。

3.2 添加杜仲葉對牦牛瘤胃液體外DMD、CPD、NDFD 及 ADFD 的 影 響 DMD、CPD、NDFD和ADFD能夠反映瘤胃微生物對底物分解程度的強弱（趙慧娟等，2006）。瘤胃微生物對發(fā)酵底物的降解程度不僅與微生物活性有關(guān)，還與發(fā)酵底物的組成有關(guān)。本試驗中，DMD和CPD顯著提高，在添加量為4%時達到最大值后下降，可能是因為隨著杜仲葉添加量的增加，供瘤胃微生物發(fā)酵利用的碳水化合物和營養(yǎng)物質(zhì)增加，使體外發(fā)酵DMD和CPD呈上升趨勢。孟梅娟等（2016）的試驗中，NDFD和 ADFD先增加后降低，本試驗中，隨著杜仲葉添加量的增加，體外發(fā)酵72 h后的 NDFD和ADFD先增加后降低，在添加量為4%時達到最大值，可能是杜仲葉的添加，增加了日糧中的可發(fā)酵物質(zhì)，加快微生物對發(fā)酵底物的利用，但是當杜仲葉的添加量過大時，體外發(fā)酵可能受到抑制，NDFD和ADFD反而下降，因此杜仲葉應(yīng)該適量添加。

3.3 添加杜仲葉對牦牛瘤胃液體發(fā)酵參數(shù)pH、NH3-N濃度和MCP濃度的影響 反芻動物對飼料營養(yǎng)物質(zhì)進行消化吸收主要是通過瘤胃中的微生物發(fā)酵，而瘤胃液的pH是評價瘤胃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵和瘤胃穩(wěn)定的重要指標，其直接反映瘤胃內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和動物體的健康狀況（Nagaraja等，2007）。在正常生理狀態(tài)下，反芻動物采食后，瘤胃中的pH呈動態(tài)變化，先逐漸下降再逐漸升高。李新等（2012）研究表明，反芻動物瘤胃液的pH正常變化范圍為5.5～7.5，本試驗瘤胃液pH均在6.33～6.46范圍內(nèi)變化，并且隨著杜仲葉添加量的增加，無顯著變化。劉彩娟等（2011）研究表明，在日糧中添加復(fù)合益生菌對瘤胃pH影響不顯著；陳亮等（2017）研究植物乳桿菌對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵特性的影響，其結(jié)果對瘤胃pH影響不顯著，并且認為其對于維持pH的穩(wěn)定平衡具有積極作用。本試驗結(jié)果與劉彩娟等（2011）和陳亮等（2017）的結(jié)果一致，表明在基礎(chǔ)日糧中添加不同水平的杜仲葉對瘤胃pH沒有影響。

NH3-N作為反映瘤胃發(fā)酵的一個重要指標，主要受日糧中蛋白質(zhì)水平、瘤胃上皮的吸收作用、瘤胃微生物的合成與利用以及食糜的排空速度等因素的影響。瘤胃中適宜的NH3-N濃度才能保證微生物蛋白的正常合成。研究表明，瘤胃中的NH3-N濃度為6.3～27.5 mg/100 mL時，最適宜微生物發(fā)酵 （Murphy等，1987）。本研究中72 h發(fā)酵后NH3-N的濃度為35.28～30.69 mg/100 mL，與 Murphy等（1987）研究中的 NH3-N 適宜濃度相比，本研究中的NH3-N濃度相對偏高，可能原因是由于在本試驗中采用的體外產(chǎn)氣裝置是塑料針筒，產(chǎn)生的部分NH3-N無法像在真正的瘤胃一樣被瘤胃上皮吸收和隨著食糜排出。史仁煌等（2015）研究表明，日糧中添加杜仲素顯著降低了瘤胃中的NH3-N濃度。本試驗中，NH3-N的濃度隨著杜仲添加量的增加顯著降低，與史仁煌的研究結(jié)果一致，可能原因是杜仲葉中含有多種具有抑菌作用的物質(zhì)，不同程度的抑制產(chǎn)氨活性較強的專性氨基酸發(fā)酵菌的活性，從而降低瘤胃中NH3-N的濃度。

瘤胃中MCP濃度的高低可反映瘤胃微生物利用NH3-N的能力，同時，也可反映瘤胃中微生物種群的數(shù)量，MCP可為反芻動物提供蛋白質(zhì)需要的40%～80%，是主要的氮源提供者。本試驗中，瘤胃MCP濃度隨日糧中杜仲葉添加量的增加而顯著增加，可能是因為杜仲葉中富含多糖類化合物，可為瘤胃微生物提供更多的營養(yǎng)成分，從而促進瘤胃微生物利用NH3-N合成MCP。董金金等（2018）研究表明，日糧中添加酵母多糖，可降低瘤胃液中NH3-N濃度，提高MCP濃度，與本試驗結(jié)果一致，說明日糧中添加杜仲葉能夠促進牦牛瘤胃中有益菌的生長繁殖，提高氮的利用率，合成更多的MCP。

4 小結(jié)

日糧中添加杜仲葉對瘤胃體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量、最大潛在產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率、產(chǎn)氣前停滯時間和pH均沒有影響；日糧中添加杜仲葉可顯著提高日糧DM、CP、ADF及NDF的降解率，并隨添加量的增加呈二次曲線變化，當添加量為4%時，達到最大值；瘤胃液中NH3-N濃度隨杜仲葉添加水平的提高呈線性下降，而瘤胃液中MCP濃度隨杜仲葉添加水平的提高呈二次曲線變化，添加量為3%時，MCP濃度達到峰值。日糧中杜仲葉適宜添加量為3%～4%。