蝦青素對(duì)小鼠結(jié)腸急性氧化損傷的保護(hù)作用

張子琪，朱凌羽，劉惠麟，李若楠，郎伍營(yíng)，吳 旻，蘭海楠，鄭 鑫

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

腸道是機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要器官，也是機(jī)體內(nèi)最大的免疫器官。受環(huán)境及飲食因素影響，動(dòng)物腸道尤其是在低齡家畜中，極易出現(xiàn)腸道炎癥而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。炎癥性腸病包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，是一組非特異性腸道慢性炎癥疾病，可增加結(jié)直腸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[1]，它是由各種環(huán)境因素引起，如胃腸道感染、非甾體抗炎藥物使用或其他環(huán)境毒素等[2]。隨著生活水平的提高，市場(chǎng)對(duì)于畜產(chǎn)品的需求量越來(lái)越大，亟待解決的問(wèn)題之一就是用天然的飼料添加劑徹底替換抗生素類藥物，使畜禽健康成長(zhǎng)的同時(shí)可自身抵御外界疾病。

蝦青素（Astaxanthin，ATX）是一種紅橙色的葉黃素類胡蘿卜素，具有強(qiáng)抗氧化性。雨生紅球藻是天然蝦青素的豐富來(lái)源，鮭科魚類、蝦類等甲殼類生物體內(nèi)也含有蝦青素[3]。許多研究表明，蝦青素具有抗氧化、抗炎和抗癌特性等多種生物活性，可降低人類及動(dòng)物多種疾病的發(fā)生[4-5]，現(xiàn)已被美國(guó)食品藥物管理局和歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)作為食品添加劑。目前關(guān)于蝦青素的研究大都是單一、孤立地研究其某一特性，但炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。為此，本試驗(yàn)以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)，建立急性小鼠結(jié)腸炎癥模型，研究蝦青素對(duì)炎癥因子水平和氧化損傷程度的影響，來(lái)說(shuō)明蝦青素對(duì)小鼠急性結(jié)腸炎癥反應(yīng)的抑制作用和對(duì)結(jié)腸氧化損傷的保護(hù)作用，并通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路探討兩者之間的關(guān)系，為蝦青素作為食品和飼料添加劑的使用以及其在炎癥性腸病防治中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 隨機(jī)將6 周齡、體重均為（18±1）g 的32 只雄性ICR 小鼠（購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司）分為4 組（對(duì)照組、蝦青素組、LPS 組和蝦青素保護(hù)組），每組8 只。在LPS 注射前連續(xù)15 d，對(duì)照組與LPS 組小鼠灌胃橄欖油，蝦青素組與蝦青素保護(hù)組灌胃50 mg/kg 蝦青素，蝦青素（雅仕達(dá)生物技術(shù)有限公司，純度：2%）溶于橄欖油中。小鼠在第15 天灌胃后禁食12 h，之后LPS 組和蝦青素保護(hù)組小鼠按1 mg/kg 劑量腹腔注射LPS，LPS 溶于無(wú)菌生理鹽水中。同時(shí)，對(duì)照組和蝦青素組注射等量無(wú)菌生理鹽水。

小鼠飼養(yǎng)在12 h 明暗交替循環(huán)、室溫（25±1）℃的無(wú)菌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境1 周后進(jìn)行試驗(yàn)。所有小鼠均飼喂標(biāo)準(zhǔn)小鼠日糧，在整個(gè)飼養(yǎng)期間保證小鼠自由攝食和飲水。

1.2 樣品采集 各組小鼠在LPS/生理鹽水腹腔注射3 h后，進(jìn)行血液和結(jié)腸組織采集。采集血液：小鼠眼球采血，血液置于1.5 mL 離心管中，室溫下靜置30 min 以析出血清，4℃，3 500 r/min 離心15 min 分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。結(jié)腸組織采集：頸椎脫臼處死小鼠，迅速自肛門上2 cm 處向上分離結(jié)腸6～8 cm，4% 多聚甲醛溶液固定，待做組織切片；其余腸組織置于生理鹽水中清洗，吸干水分后在液氮中速凍，之后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA 檢測(cè)各組小鼠血清中炎性水平 根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D System）說(shuō)明書，分別檢測(cè)和計(jì)算各組小鼠血清中腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、 白 細(xì) 胞 介 素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和髓過(guò)氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）含量，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)并且每個(gè)樣本測(cè)3 個(gè)重復(fù)值。Thermo 酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾）檢測(cè)。

1.4 Western blot 檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中p-NF-κB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量 取出凍存的腸段組織，用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），在冰上進(jìn)行組織勻漿，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度。取20 g 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用5%的BSA 封閉1 h，一抗為鼠源的p-NF-κB p65抗體（1∶1 000），兔源的β-actin 抗體（1∶5 000）（美國(guó) CST），4℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜后分別加入相應(yīng)的二抗∶HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶3 000）和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶3 000）（天津三箭生物技術(shù)有限公司），37℃孵育1 h 。TBST 洗膜后，凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad）感光顯色，目的條帶用 Image J 進(jìn)行灰度分析，用目的條帶灰度值比上內(nèi)參（β-actin）條帶灰度值計(jì)算出蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 結(jié)腸組織中抗氧化指標(biāo)測(cè)定 取部分結(jié)腸組織，用冰凍的生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，剪碎后加入9 倍生理鹽水，在冰浴中機(jī)械勻漿成10%勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，按南京建成生物研究所有限公司相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明操作測(cè)定結(jié)腸組織蛋白、丙二醛（MDA）含量與超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）等抗氧化酶活性。1 個(gè)酶活力單位（U）表示每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol 底物的酶量。

1.6 熒光定量PCR 檢測(cè)各組結(jié)腸組織中炎性因子及抗氧化酶mRNA 相對(duì)表達(dá)量 熒光定量PCR 檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、一氧化氮合酶（Induced Nitric Oxide Synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶（cyclooxygenase-2，COX-2）和SOD、GSHPx、CAT 等抗氧化酶的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)上海ExCell 公司RNA Lyzol 說(shuō)明書提取各個(gè)腸段組織RNA，并測(cè)得所有樣品濃度和質(zhì)量，OD260/280在1.8～2.0，可用于下一步試驗(yàn)。然后按照美國(guó)Gene Copoeia 公司cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后進(jìn)行熒光定量PCR，采用20 μL 反應(yīng)體系：SYBR（日本TaKaRa）10 μL，上、下游引物各1 μL、cDNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL，在美國(guó)Bio-Rad 熒光定量PCR儀中按照95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，39 個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR 反應(yīng)，每次試驗(yàn)均設(shè)置18S 作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算炎性因子mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。所用引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成（表1）。

1.7 結(jié)腸組織病理學(xué)分析 將各組小鼠結(jié)腸用一系列濃度梯度的乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水，經(jīng)蘇木精- 伊紅（HE）染色，中性樹脂封片后光鏡檢查。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2010 整理，利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 如圖1 所示，對(duì)照組與蝦青素組結(jié)腸結(jié)構(gòu)正常；LPS 組結(jié)腸損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)黏膜糜爛、水腫，黏膜層和固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加；蝦青素保護(hù)組黏膜受損較輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)較少，極少出現(xiàn)絨毛頂端破損，絨毛狀態(tài)均勻完整。提示急性結(jié)腸炎癥模型建立成功，蝦青素可預(yù)防急性炎癥帶來(lái)的結(jié)腸形態(tài)損傷。

表1 熒光定量PCR 引物序列表

圖1 光鏡下各組小鼠結(jié)腸黏膜組織HE 染色（×100）

2.2 蝦青素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠血液炎性因子的影響 由表2 可 知，LPS 組 血 清 中 炎 性 因 子TNF-α、IL-6、IL-1β 及MPO 的分泌量高于對(duì)照組、蝦青素組和蝦青素保護(hù)組（P＜0.05），提示蝦青素降低了LPS 誘導(dǎo)的血清炎性因子的分泌量，蝦青素對(duì)細(xì)胞炎癥因子的分泌有一定抑制作用。

2.3 蝦青素對(duì)小鼠結(jié)腸組織氧化水平的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，LPS 組小鼠結(jié)腸組織MDA 含量升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px、CAT 活性降低（P＜0.05）；與LPS 組相比，蝦青素保護(hù)組小鼠結(jié)腸組織MDA 含量降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px、CAT 活性升高（P＜0.05）。提示LPS 組小鼠結(jié)腸的抗氧化水平顯著降低，氧化損傷明顯，而蝦青素保護(hù)能明顯改善小鼠結(jié)腸抗氧化能力，降低結(jié)腸氧化損傷。

2.4 蝦青素對(duì)小鼠結(jié)腸組織炎性因子及抗氧化酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 如圖2 顯示，與LPS 組相比，蝦青素保護(hù)組可降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和炎癥相關(guān)誘導(dǎo)型iNOS、COX-2 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05），提高抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。表明蝦青素可抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2 等基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)提高抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 等mRNA 水平，進(jìn)而緩解結(jié)腸組織的急性損傷。

2.5 蝦青素對(duì)小鼠結(jié)腸p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響如圖3 所示，LPS 組結(jié)腸組織中p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組和蝦青素保護(hù)組（P＜0.05）。由此推測(cè)，蝦青素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎癥的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制NF-κB p65 蛋白的活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

表2 蝦青素對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MPO 的影響

表3 蝦青素對(duì)小鼠結(jié)腸組織SOD、GSH-Px、CAT、MDA 的影響

圖2 蝦青素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎性因子和抗氧化酶mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

圖3 蝦青素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠腸道p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

炎癥是通過(guò)消除有害刺激來(lái)對(duì)機(jī)體進(jìn)行自身保護(hù)的過(guò)程，通常是有益的，但如果持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，會(huì)導(dǎo)致宿主患各種慢性疾病，進(jìn)而引發(fā)癌癥[6]。炎癥在激活腫瘤形成中至關(guān)重要，并且炎癥誘導(dǎo)的細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-1β）可促進(jìn)腫瘤的形成。另外，參與腫瘤起始、促進(jìn)和轉(zhuǎn)移的幾種基因（如COX-2、MMP-9、iNOS、TNF-α、IL-8 等）均由NF-κB 編碼和調(diào)節(jié)[7]，其與人和小鼠腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)[8]。此外，許多致癌基因和致癌物質(zhì)也會(huì)引起NF-κB 的活化，而具有已知化學(xué)預(yù)防特性的化學(xué)物質(zhì)可以抑制NF-κB 的活化。研究表明，蝦青素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)NF-κB、COX-2、MMPs-2/9、Akt、ERK-2 的表達(dá)，對(duì)二甲基肼誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌顯現(xiàn)出抗癌作用[9]。另外，選擇性COX-2抑制劑可降低NF-κB 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而緩解大鼠結(jié)腸病變[10]。綜上說(shuō)明蝦青素可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因來(lái)緩解炎癥反應(yīng)。

LPS 又稱內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜中的主要成分，可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，增強(qiáng)許多炎性因子（如TNF-α、IL-6 和IL-1β 等）的分泌和表達(dá)，因此可通過(guò)檢測(cè)這些因子的分泌和表達(dá)量來(lái)衡量炎癥的嚴(yán)重程度[11]。給小鼠注射LPS 后，巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞釋放炎性因子，最初的促炎性細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 被激活，刺激IL-1β、IL-8 等下游細(xì)胞因子表達(dá)，它們都在細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)中起到重要作用[12]。許多體內(nèi)和體外研究顯示，蝦青素給藥減少了TNF-α、IL-1β 和IL-6 的釋放并可通過(guò)抑制膿毒癥大鼠模型中的炎癥來(lái)保護(hù)多器官免受損傷[13-14]。再者，研究表明添加蝦青素的飲食可以降低黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)的肝臟組織中MPO水平升高[15]。本研究結(jié)果表明，蝦青素顯著降低LPS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 和MPO 的分泌，可下調(diào)組織中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 及炎癥相關(guān)酶iNOS、COX-2 的mRNA 水平并可抑制NF-κB p65 蛋白的活化。

氧化應(yīng)激是由于氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量ROS。過(guò)量ROS 可能導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮的炎癥損傷[16]。機(jī)體通過(guò)抗氧化酶（如SOD、GSH-Px、CAT）以及非酶抗氧化劑（如維生素E、β-胡蘿卜素等）來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化還原水平[17]。氧化還原平衡被打破后，一些與自由基代謝有關(guān)的抗氧化酶和保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的抗氧化劑通常被耗盡。另外，MDA 是過(guò)量ROS 誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，廣泛用作氧化應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)志物[18]。本研究結(jié)果顯示，蝦青素可顯著提高LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎癥組織中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px 的活性及其基因的表達(dá)，同時(shí)顯著降低MDA 含量，并且通過(guò)HE 染色從病理形態(tài)學(xué)角度表明了蝦青素對(duì)急性結(jié)腸炎的預(yù)防作用。值得注意的是，在對(duì)急性肺損傷的研究中發(fā)現(xiàn)蝦青素能夠下調(diào)NF-κB p65 的表達(dá)，緩解氧化應(yīng)激并抑制炎癥[14]。此外，NF-κB、IL-6、IL-8、IFN-γ 等細(xì)胞因子能刺激炎性細(xì)胞誘導(dǎo)iNOS 蛋白表達(dá)上調(diào)產(chǎn)生大量NO，參與炎癥反應(yīng)[19]。說(shuō)明炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的發(fā)生很有可能是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路相連。研究表明，蝦青素具有比角黃素、β-胡蘿卜素或玉米黃質(zhì)高十倍的抗氧化活性，它可以減緩氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激，保護(hù)細(xì)胞和組織免受自由基損傷[20]。人體血液檢測(cè)的結(jié)果顯示，每天補(bǔ)充蝦青素可以下調(diào)炎癥細(xì)胞因子（如IL-6 和IFN-γ）的水平，并抑制活性氧和活性氮的產(chǎn)生[21]。因此，蝦青素通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路調(diào)節(jié)的一系列機(jī)制有可能首先來(lái)自于其強(qiáng)大的抗氧化性。

盡管許多研究表明蝦青素有很強(qiáng)的抗炎和抗氧化性，但它在炎癥性腸病中確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索?？赏ㄟ^(guò)NF-κB 這一條關(guān)鍵的信號(hào)通路研究其與炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡壞死等機(jī)制。另外，蝦青素對(duì)結(jié)腸的保護(hù)作用也可能來(lái)自于其對(duì)腸道功能完整性的保護(hù)和對(duì)腸道菌群環(huán)境的改善。蝦青素現(xiàn)已被用作保健品或食品添加劑，這些都預(yù)示著服用蝦青素是一種預(yù)防和治療炎癥性腸病的新方法。由于本研究?jī)H基于動(dòng)物試驗(yàn)，尚需對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究并開展前瞻性臨床研究來(lái)評(píng)估蝦青素是否適用于急性結(jié)腸炎的臨床治療。

4 結(jié) 論

本研究表明，蝦青素可以通過(guò)抑制NF-κB p65 的活化降低血液和結(jié)腸組織中炎癥水平，提高結(jié)腸中抗氧化能力，從而減輕LPS 誘導(dǎo)的急性結(jié)腸損傷；此外，蝦青素還可維持腸道黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，其潛在的作用機(jī)制可能受益于其強(qiáng)大的抗氧化和抗炎活性。蝦青素作為食品和飼料添加劑可能開辟出預(yù)防和治療炎癥性腸病的新途徑。