適用于豬場沼液處理的好氧反硝化菌篩選及其脫氮特性評價(jià)

孫 宏，吳逸飛，張 恒,2，沈 琦，姚曉紅，王 新，湯江武*，葛向陽

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430030）

近年來，隨著畜禽規(guī)模化養(yǎng)殖程度提高，養(yǎng)殖污染問題日益突出，成為限制畜牧業(yè)發(fā)展的重要瓶頸。沼液是畜禽污水經(jīng)過厭氧沼氣工程處理后的產(chǎn)物，其含有較多的有機(jī)物及氮、磷等污染物，無法直接排放，需進(jìn)一步處理才能避免對環(huán)境的影響[1]。目前較為常見的沼液處理工藝包括物理、化學(xué)和生物等多種手段[2-3]，其中微生物處理沼液技術(shù)由于占地面積小、成本較低等優(yōu)勢在沼液凈化中發(fā)揮了重要作用[3]。但經(jīng)過微生物處理后沼液中氨氮含量有較大程度降解，而總氮（TN）去除率仍偏低，特別是生化處理出水中仍含有大量硝酸鹽氮，具有潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。

傳統(tǒng)硝酸鹽氮的去除需要嚴(yán)格厭氧環(huán)境，且較易受到氧氣或亞硝酸鹽的抑制。好氧反硝化途徑的發(fā)現(xiàn)為硝酸鹽氮在好氧條件下的去除提供了新思路[6]。近年來，國內(nèi)外研究陸續(xù)從生活污水處理廠活性污泥[7-9]、海灣沉積物[10]、農(nóng)用肥土壤[11]等多種來源篩選獲得好氧反硝化菌株，均對去除硝酸鹽氮和TN 有良好效果。雖然目前在好氧反硝化菌的篩選方面開展了一些研究，但從處理豬場沼液系統(tǒng)的好氧污泥中有針對性地篩選適合其脫氮處理菌株的研究仍較少，特別是在處理沼液實(shí)際應(yīng)用時(shí)合適菌劑添加量方面的報(bào)道。

因此，本研究嘗試從畜禽污水處理廠的活性污泥中篩選好氧反硝化菌，并對其在不同氮源下的脫氮特性進(jìn)行研究，探討不同好氧反硝化菌添加量對沼液污染物的去除效果，為利用好氧反硝化菌處理沼液實(shí)現(xiàn)高效脫氮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 污泥來源與沼液水質(zhì)指標(biāo) 污泥來自運(yùn)行穩(wěn)定良好的浙江安吉吉成牧業(yè)養(yǎng)殖場處理沼液的缺氧-好氧污水處理系統(tǒng)的曝氣池。沼液取自浙江金帆生態(tài)養(yǎng)殖有限公司黑膜厭氧發(fā)酵池，化學(xué)需氧量（COD）、氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、TN 和pH 等水質(zhì)指標(biāo)見表1。

表1 豬場沼液污染物指標(biāo)

1.2 培養(yǎng)基 反硝化富集培養(yǎng)基：Na3C6H5O7·2H2O 6 g/L、KNO31 g/L、KH2PO41.5 g/L、Na2HPO40.42 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、CuSO4·5H2O 4.0 mg/L、FeSO4·7H2O 0.7 mg/L、FeCl3·6H2O 7.0 mg/L、CoCl3·6H2O 0.2 mg/L、Na2MO4·2H2O 3.4 mg/L、CaCl2·2H2O 2.0 g/L，pH 7.2。

溴百里酚藍(lán)（BTB）鑒定培養(yǎng)基[12]：Na3C6H5O7·2H2O 6 g/L、KNO31.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.05 g/L、CaCl2·2H2O 0.2 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、1% BTB 1.0 mL/L，pH 6.8。

反硝化性能測定培養(yǎng)基：Na3C6H5O7·2H2O 6.0 g/L、KNO31.0 g/L、KH2PO40.75 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.2。

氨氮降解性能測定培養(yǎng)基：NH4Cl 0.382 g/L、CH3CO ONa 3.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、K2HPO40.2 g/L、NaCl 0.12 g/L、MnSO4·4H2O 0.01 g/L、FeSO40.01 g/L，pH 7.2。

亞硝酸鹽氮降解性能測定培養(yǎng)基：NaNO20.15 g/L、CH3COONa 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、K2HPO40.2 g/L、NaCl 0.12 g/L、MnSO4·4H2O 0.01 g/L、FeSO40.01 g/L，pH 7.2。

上述平板培養(yǎng)基配制時(shí)需加入1.5%～2.0%瓊脂粉。

1.3 好氧反硝化菌的初篩 取新鮮活性污泥1 g 采用5 mL無菌0.9% 生理鹽水離心重懸2 次后，取1 mL 重懸液接種至100 mL 反硝化富集培養(yǎng)基中（300 mL 三角瓶），在30℃、160 r/min 下恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔1 d 按1%（v/v）接種量轉(zhuǎn)接至新的反硝化富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集4 次后，采用10 倍梯度稀釋在BTB 鑒定平板上涂布。挑取平板上具有藍(lán)色暈圈的單菌落進(jìn)行連續(xù)劃線純化，將純化后的單菌落在LB 斜面4℃保存。

1.4 好氧反硝化菌的復(fù)篩 活化初篩菌株，接種到反硝化性能測定培養(yǎng)基上，在30℃、160 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，進(jìn)行TN、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮等指標(biāo)的檢測。根據(jù)TN 和硝酸鹽氮去除率篩選出最優(yōu)菌株。

1.5 菌種形態(tài)觀察及測序鑒定 將純化后的優(yōu)選菌株在BTB 固體培養(yǎng)基上涂布，觀察菌株的菌落形態(tài)。用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取總DNA。分別進(jìn)行篩選菌株的反硝化功能基因nirS 和nosZ 檢測和16S rDNA 鑒定，nirS 基因檢測所用上下游引物為Flacd：5′-TA（C/T）CACCC（C/G）GA（A/G）CCG C -3'和R3cd：5′-GA（C/G）TTCGG（A/G）TG（C/G）GTCTTG A -3′[13]；nosZ 基因檢測引物為nosZ-F：5′-CG（C/T）TGTTC（A/C）TCGACA GCC AG-3′ 和nosZ-1622R：5′-CG（C/G）ACCTT（C/G）TTGCC（C/G）T（C/T）GCG -3′[14]；菌株的16S rDNA 檢測采用通用引物為27F 和1492R[8]。

PCR 體系：10×transtaq Buffer 5 μL（含有15 mmoL/L的Mg2+），dNTP（2.5 mmoL/L）4 μL，上、下游引物（10 μmmoL/L）各0.8 μL，DNA 模板2 μL（約30 ng），Taq 酶0.4 μL，ddH2O 補(bǔ)至50 μL。PCR 程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，31 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交生工生物工程（上海）有限責(zé)任公司測序，用Bioedit 7.0 軟件進(jìn)行測序后DNA 序列分析和拼接。測序結(jié)果遞交NCBI 數(shù)據(jù)庫經(jīng)過Blast 程序?qū)Ρ群螅x取同源性高的序列采用MEGA 7.0軟件中Neighbor-Joining 算法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.6 好氧反硝化菌的脫氮性能測試 挑取單菌落分別接種于反硝化性能測定培養(yǎng)基、亞硝酸鹽降解性能測定培養(yǎng)基和氨氮降解性能測定培養(yǎng)基，30℃、160 r/min 條件下恒溫振蕩培養(yǎng)1 d，制得相應(yīng)種子液。

分別取上述菌液按照1%（v/v）接種至裝有100 mL反硝化性能測定培養(yǎng)基、亞硝酸鹽降解性能測定培養(yǎng)基和氨氮降解性能測定培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，于30℃、160 r/min 條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。其中反硝化性能測定培養(yǎng)基、亞硝酸鹽降解性能測定培養(yǎng)基每隔6 h 取樣，氨氮降解性能測定培養(yǎng)基每隔4 h 取樣，分別檢測OD600、TN、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮或氨氮等含量，直至各指標(biāo)趨于穩(wěn)定。

1.7 好氧反硝化菌對滅菌沼液的脫氮效果評價(jià) 接種菌株至含有200 mL 滅菌沼液的500 mL 三角瓶中至菌終濃度分別為105、106、107、108CFU/mL，以不接菌的滅菌沼液為對照組，在30℃、160 r/min 下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔12 h 取樣10 mL 沼液，檢測硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮和COD 的變化情況。每組試驗(yàn)包含3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)周期為2 d。

1.8 水質(zhì)指標(biāo)檢測方法 水質(zhì)檢測均采用國標(biāo)方法，其中氨氮檢測方法采用《水質(zhì)氨氮的測定-水楊酸分光光度法》（GB 7481-87）；硝酸鹽氮含量檢測采用《水質(zhì)硝酸鹽氮的測定-紫外分光光度法》（HZ-HJ-SZ-0138）；TN 檢測方法采用《水質(zhì)總氮的測定-堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》（GB-11894-89）；亞硝酸鹽氮的測定采用《水質(zhì)亞硝酸鹽氮的測定-分光光度法》（GB 7493-87）；COD 檢測方法采用《水質(zhì)化學(xué)需氧量的測定-重鉻酸鹽法》（GB 11914-89）。降解速率公式：

式中，v 為t 時(shí)間內(nèi)的平均污染物降解速率，單位為mg/（L·h）；p0為初始氨氮、硝酸鹽或亞硝酸鹽濃度，單位為mg/L；pt為培養(yǎng)t 時(shí)間后對應(yīng)氨氮、硝酸鹽或亞硝酸鹽濃度，單位為mg/L；t 為培養(yǎng)或處理時(shí)間[7,11]。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)處理采用Excel 軟件進(jìn)行，除初篩結(jié)果外，均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13.0進(jìn)行單因子方差分析，多重比較采用Duncan's 檢驗(yàn)，P＜0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選 經(jīng)過富集培養(yǎng)后，從BTB 鑒定平板中共挑取到16 株菌落形態(tài)有明顯差異且周圍有藍(lán)色暈圈的菌株，分別命名為ZH-1 至ZH-16。反硝化性能鑒定培養(yǎng)基的搖瓶復(fù)篩結(jié)果見表2。相較于其余菌株，菌株ZH-14 的TN 和硝酸鹽氮的去除效果均最好，分別達(dá)到50.73%和99.99%，并在培養(yǎng)后僅有0.031 mg/L 的亞硝酸鹽氮積累。因而選取菌株ZH-14 進(jìn)行后續(xù)鑒定和脫氮能力檢測。

2.2 菌株ZH-14 的形態(tài)觀察、測序鑒定和分類 BTB平板鑒定結(jié)果顯示，ZH-14 能夠在以硝酸鉀為唯一氮源的固體平板上進(jìn)行反硝化產(chǎn)堿作用，提高培養(yǎng)基中的pH，使BTB 由綠變藍(lán)（圖1）。菌株ZH-14 在BTB平板上單菌落形態(tài)前期呈圓形、淡黃色、表面光滑、不透明、有凸起、易挑起；生長后期表面生成淡黃色褶皺，菌落表面積變大。

由圖2 可知，nirS 和nosZ 2 種功能基因的擴(kuò)增跑膠鑒定均呈陽性，序列長度在500 bp 左右，測序經(jīng)過Blast 對比后發(fā)現(xiàn)，序列分別與施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri，P. stutzeri）LYS-86 亞硝酸鹽還原酶基因（登錄號(hào)：GU474546）和施氏假單胞菌Gr50 的NosZ 基因（登錄號(hào)：HE814034）相似度最高，均達(dá)到99%，進(jìn)一步證明菌株ZH-14 具有反硝化脫氮能力。同時(shí)，挑選9 株與其16S rDNA 的同源性相似度達(dá)到99%以上的典型菌株進(jìn)行多重序列對比并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明菌株ZH-14 屬于施氏假單胞菌。

表2 好氧反硝化菌的初篩 mg/L

圖1 菌株ZH-14 在BTB 鑒定平板上的菌落形態(tài)

2.3 菌株ZH-14 對不同氮素脫氮能力的分析 由圖4-A可知，當(dāng)菌株ZH-14 以硝酸鉀為唯一氮源生長時(shí)，在24 h 進(jìn)入對數(shù)生長期，48 h 時(shí)菌體濃度OD600為0.89。培養(yǎng)36 h 后硝酸鹽氮基本降解完畢，48 h 時(shí)硝酸鹽氮與TN 的降解率分別為100%和41.76%，降解速率分別達(dá)到2.85 mg 硝酸鹽氮/（L·h）和0.95 mg TN/（L·h）。與0 h 相比，在培養(yǎng)30 h 時(shí)亞硝酸鹽氮有微弱積累，達(dá)到12.47 mg/L（P＜0.05），隨后完全降解；氨氮含量則全過程均低于1.0 mg/L，各時(shí)間點(diǎn)無明顯積累（P＞0.05）。

圖2 菌株ZH-14 的16S rDNA（A）、nirS（B）和nosZ 基因（C）的PCR 擴(kuò)增電泳圖

圖3 菌株ZH-14 的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

由圖4-B 可知，當(dāng)菌株ZH-14 以亞硝酸鈉為唯一氮源培養(yǎng)時(shí)，與初始相比，菌株生長12 h 進(jìn)入對數(shù)生長期，最高OD600達(dá)到0.23（P＜0.05）。亞硝酸鹽氮在24 h內(nèi)基本降解完畢，僅為0.21 mg/L，降解率為99.24%（P＜0.05）。TN 含量先降后升，最終達(dá)21.61 mg/L，降解率為19.0%（P＜0.05）；同時(shí)氨氮在培養(yǎng)過程中有少量積累，培養(yǎng)30 h 時(shí)濃度最高，為1.63 mg/L。

目前分離出的大多數(shù)好氧反硝化菌都具有異養(yǎng)硝化特性，為驗(yàn)證菌株ZH-14 是否具有異養(yǎng)硝化特性，本研究以氨氮為唯一氮源，考察不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)菌株ZH-14 的生長情況及對不同氮素的降解情況。

由圖4-C 可知，菌株ZH-14 在以氨氮為唯一氮源培養(yǎng)時(shí)，8 h 進(jìn)入對數(shù)生長期，20 h 時(shí)達(dá)到最大吸光度（OD600）0.881，顯著高于初始值，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。在菌株生長過程中，氨氮的降解在培養(yǎng)24 h 后趨于穩(wěn)定，剩余6.64 mg/L，降解率達(dá)94.1%（P＜0.05）；TN 含量從初始102.4 mg/L 下降到97.2 mg/L，降解率為5.08%（P＞0.05）；同時(shí)硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮含量在全過程均低于0.2 mg/L，無明顯積累。

圖4 菌株ZH-14 在硝酸鉀（A）、亞硝酸鈉（B）和氨氮（C）為唯一氮源培養(yǎng)基中的生長曲線及對不同氮素含量的影響

2.4 不同濃度的菌株ZH-14 對沼液污染物含量的影響 在氨氮去除方面（圖5-A），與不投菌組相比，105CFU/mL 投菌組的氨氮降解速率最慢，106CFU/mL 投菌組的氨氮降解速率在24 h 前與107CFU/mL 和108CFU/mL 投菌組無顯著差異（ P＞0.05）。在培養(yǎng)48 h 后，107CFU/mL 和108CFU/mL 投菌組的氨氮降解率顯著高于其余組（P ＜0.05），分別為55.4% 和54.48%。在硝酸鹽氮去除方面（圖5-B），與其他組相比，107CFU/mL 投菌組的硝酸鹽氮去除率最高（P＜0.05），為97.7%。在COD 去除方面（圖5-C），105CFU/mL投菌組在培養(yǎng)早期對COD 的降解效率顯著低于其他投菌組（P＜0.05），但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長， 48 h 時(shí)4 個(gè)投菌組對COD 降解差異不明顯（P＞0.05）。在亞硝酸鹽氮方面（圖5-D），與對照組相比，4 個(gè)試驗(yàn)組在前24 h均有不同程度的亞硝酸鹽氮積累，其中106CFU/mL 投菌組積累情況最為明顯，最高達(dá)到9.95 mg/L（P＜0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，亞硝酸鹽氮含量逐漸下降，與對照相比，其中以107CFU/mL 投菌組最低，為1.49 mg/L（P＜0.05）。

圖5 投加不同終濃度的菌株ZH-14 處理沼液后對其污染物指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 好氧反硝化菌的篩選及對不同氮素的利用特性 本研究經(jīng)過活性污泥原位富集篩選的方式獲得1 株施氏假單胞菌ZH-14，該菌株表現(xiàn)出了較好的好氧反硝化能力和脫氮能力。目前篩選的反硝化菌主要包括14 個(gè)屬37 個(gè)種，其中以假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）和產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）最為常見，施氏假單胞菌也占有較大比例[15]。Yao 等[16]通過低溫運(yùn)行好氧反硝化工藝對原位富集到的反硝化功能菌群進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬菌株在培養(yǎng)后數(shù)量占比顯著增加，并占主導(dǎo)地位，表明該類微生物較適宜反硝化的運(yùn)行環(huán)境。

本研究表明，菌株ZH-14 在以硝酸鹽為唯一氮源時(shí)，硝酸鹽氮和TN 均隨菌體生長而顯著降低。由于本試驗(yàn)測定的TN 包含菌體細(xì)胞內(nèi)氮含量，因此可推測該菌株主要通過好氧反硝化作用實(shí)現(xiàn)脫氮，這與許濤等[17]的研究一致。本研究中，硝酸鹽氮的降解速率為2.85 mg 硝酸鹽氮/（L·h），高于信欣等[18]采用不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）細(xì)菌降解硝酸鹽氮的速率，但低于王田野等[11]報(bào)道的5.48 mg/L·h 的速率，可見不同菌株的脫氮效率有差異。本研究中，菌株ZH-14 具有好氧反硝化功能，且其反硝化過程包含了極低含量的亞硝酸鹽氮積累，該結(jié)果與Sun 等[19]所報(bào)道的施氏假單胞菌T13 的脫氮性能一致，符合傳統(tǒng)反硝化過程中硝酸鹽先還原成亞硝酸鹽，隨后亞硝酸鹽濃度再降低的過程。此外，由于ZH-14 菌株同時(shí)具有NosZ 和NirS 2 種反硝化基因，可實(shí)現(xiàn)亞硝酸鹽氮的快速降解，因而試驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)好氧反硝化過程中有大量亞硝酸鹽氮積累[20]。

本研究嘗試以氨氮為唯一氮源來探討菌株ZH-14是否具有異養(yǎng)硝化作用，發(fā)現(xiàn)氨氮去除率最高可達(dá)94.1%，低于Chen 等[21]所報(bào)道的紅球菌（Rhodococcus sp.）CPZ24 在氨氮濃度為50 mg/L 條件下測得的100%去除率。考慮到本研究中培養(yǎng)基的初始氨氮濃度高達(dá)96.97 mg/L，可能影響了菌株最終對氨氮的去除效果。本研究在氨氮降解過程中并未檢測到亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮有明顯的積累，這與白潔等[10]有關(guān)脫氮卓貝爾菌（Zobellella denitrificans）的異養(yǎng)硝化報(bào)道一致。王秀杰等[7]采用氨氮為唯一氮源的培養(yǎng)基研究不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）JQ1004 的脫氮性能時(shí)，同樣只檢測到微量的硝酸鹽氮積累，并推測這可能與氨氮在氧化過程中中間產(chǎn)物迅速轉(zhuǎn)化有關(guān)。一般認(rèn)為，氨氮的異養(yǎng)硝化作用在沒有亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮積累的情況下，主要遵循從羥胺直接轉(zhuǎn)化為一氧化氮和氮?dú)膺M(jìn)而實(shí)現(xiàn)脫氮的過程[22]。但由于本研究中的TN 降解率僅為5.08%，遠(yuǎn)低于前人在異養(yǎng)硝化過程中所報(bào)道的92.5%[11]和93.53%[18]的TN 降解率，說明菌株ZH-14 對氨氮的去除可能主要為同化作用，少量則通過異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用實(shí)現(xiàn)TN 的去除。目前，有較多篩選獲得的好氧反硝化菌被發(fā)現(xiàn)可同時(shí)以氨氮為唯一氮源生長，并具有潛在的異養(yǎng)硝化功能[18,23]。但由于異養(yǎng)硝化作用的具體機(jī)制尚未完全明確，因而還無法從分子角度對篩選菌株的異養(yǎng)硝化功能直接驗(yàn)證[24]。

本研究結(jié)果表明，菌株ZH-14 可直接利用亞硝酸鹽進(jìn)行生長代謝，但當(dāng)菌株ZH-14 以亞硝酸鹽氮為唯一氮源時(shí)，其生長速率低于僅含有硝酸鹽氮和氨氮的培養(yǎng)基。信欣等[18]在氮源為亞硝酸鹽氮的反硝化培養(yǎng)基上培養(yǎng)不動(dòng)桿菌時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)，菌株的生長速率遠(yuǎn)低于以氨氮為唯一氮源的培養(yǎng)基。上述生長差異可能受到培養(yǎng)基中碳源含量及碳氮比的影響[7]。菌株脫氮有最佳的碳氮比，在一定范圍內(nèi)，脫氮效率隨碳源濃度提高而增強(qiáng)，超過或低于最佳范圍將影響菌株生長[10]。本研究中TN的降解率為19%且呈先升后降的趨勢，這可能與菌株在生長后期所進(jìn)行的內(nèi)源性呼吸作用將菌體內(nèi)源氮分解為氨氮有關(guān)[11]。同樣培養(yǎng)后期氨氮含量的積累也可受到亞硝酸鹽代謝中的同化性還原作用影響。如張培玉等[23]報(bào)道，好氧反硝化體系中可發(fā)生亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為羥胺再變?yōu)榘钡倪^程。結(jié)合研究中較低的TN 降解率，也證明菌株ZH-14 對亞硝酸鹽的降解可能包含了部分同化作用。一般認(rèn)為，水中的亞硝酸鹽積累將影響微生物的生長和代謝活動(dòng)并對水生動(dòng)物產(chǎn)生危害[25]。本研究中，菌株ZH-14 在利用氨氮、亞硝酸鹽氮或硝酸鹽氮為唯一氮源時(shí)，均未發(fā)現(xiàn)有亞硝酸鹽的大量積累，且在以亞硝酸鹽為唯一氮源的體系中生長良好，表明其具有亞硝酸鹽氮耐受能力及實(shí)際應(yīng)用潛力。

3.2 不同終濃度的菌株ZH-14 對沼液污染物含量的影響 本試驗(yàn)中，經(jīng)過2 d 的培養(yǎng)，投菌組氨氮、硝酸鹽氮和COD 的去除率分別最高達(dá)到54.48%、97.7% 和77.9%。王田野等[11]采用不動(dòng)桿菌處理豬場沼液后發(fā)現(xiàn)，廢水中氨氮、亞硝態(tài)氮和TN 的去除率分別可達(dá)97.8%、48.7% 和73.2%，略高于本研究結(jié)果。接種菌株ZH-14 后可實(shí)現(xiàn)COD 和氨氮的同步去除，較好彌補(bǔ)傳統(tǒng)生化處理在氧化氨氮時(shí)對高有機(jī)負(fù)荷不耐受的缺點(diǎn)，有利于沼液污染物的去除[12]。值得注意的是，當(dāng)投加不同終濃度的菌株ZH-14 處理滅菌沼液時(shí)，亞硝酸鹽含量在前24 h 均有不同程度的積累，且積累量高于其在合成培養(yǎng)基上的含量。研究表明，碳源是菌種反硝化功能正常運(yùn)行的限制性因素；當(dāng)碳源不足時(shí)，無法為反硝化作用提供足夠能量，可能導(dǎo)致中間產(chǎn)物，如亞硝酸鹽的積累[26]。本研究中沼液的COD/TN 為6：1，僅略高于田雪雪等[8]報(bào)道的好氧反硝化菌的碳氮比極限值（COD/TN＞4）。而王兆陽等[27]報(bào)道，假單胞菌屬細(xì)菌對碳源的需求較高，當(dāng)碳氮比低于12 時(shí)，假單胞菌屬細(xì)菌的生長和反硝化能力均會(huì)受到影響。因而亞硝酸鹽氮積累和氨氮降解不完全，均可能與碳源在培養(yǎng)后期不足有關(guān)。同時(shí)，白潔等[10]在利用Z. denitrificans菌處理混合氮源的研究中發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽氮可有效提高氨氮的去除效率，并推測該機(jī)制與硝酸鹽氮誘導(dǎo)氨氮的異養(yǎng)硝化作用有關(guān)。趙丹等[28]研究了不同氮源的混合脫氮體系中氮素的變化情況后發(fā)現(xiàn)，少量硝酸鹽氮會(huì)促進(jìn)氨氮的去除。本研究中添加不同終濃度的菌株ZH-14 后，硝酸鹽氮含量均快速下降并最終無積累，可能也對沼液中氨氮的去除造成了影響。該結(jié)果符合國外學(xué)者所提出的當(dāng)脫氮系統(tǒng)內(nèi)同時(shí)存在硝酸鹽氮和氨氮時(shí)，微生物會(huì)優(yōu)先利用硝酸鹽氮的觀點(diǎn)[29-30]。因此，后續(xù)研究可嘗試通過在沼液中繼續(xù)投加硝酸鹽氮來提高其對氨氮的降解效果。

合適的添加量對微生物發(fā)揮代謝功能十分重要。接種量過低無法實(shí)現(xiàn)沼液污染物的有效去除，而接種量過高則造成了資源浪費(fèi)，也會(huì)引起微生物的競爭性死亡[11]。韓永和等[31]報(bào)道，好氧反硝化菌的反硝化效率與其投加量直接相關(guān)。目前，對凈水微生物在沼液處理中合適的添加量尚未有定論。信欣等[18]處理高氨氮豬場廢水時(shí)投加的不動(dòng)桿菌數(shù)為廢水體積的5%。黃廷林等[32]研究表明，當(dāng)反硝化不動(dòng)桿菌的投菌量為5% 時(shí)，硝酸鹽氮的去除率最高，達(dá)到86.62%。在本研究選取的添加范圍內(nèi)，不同的投菌終濃度對污染物的去除效果相近，但初始投菌終濃度越高，降解速率越快。菌株ZH-14的合適終濃度在107CFU/mL 時(shí)，即可實(shí)現(xiàn)對沼液中COD、氨氮等污染物快速降解。需要注意的是，與前人采用的方法不同[18]，本研究為了排除外源微生物的影響而采用滅菌沼液作為試驗(yàn)原料對ZH-14 進(jìn)行評價(jià)，不能完整說明該菌在實(shí)際條件即未滅菌沼液中的應(yīng)用效果。因此，下一步有必要采用未滅菌沼液對其脫氮功能進(jìn)行進(jìn)一步研究，并綜合考慮如連續(xù)進(jìn)水情況下對其脫氮效果的影響，以完整揭示該菌作為反硝化脫氮和/或輔助同化氨氮的功能菌在沼液實(shí)際處理中的應(yīng)用前景和效果。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)從養(yǎng)殖污水污泥中分離篩選出1 株好氧反硝化菌ZH-14，經(jīng)16S rDNA 序列鑒定為施氏假單胞菌。在本試驗(yàn)條件下，該菌在污水中具有較好的好氧反硝化效果，36 h 即可實(shí)現(xiàn)硝酸鹽氮的完全降解；同時(shí)該菌在不同氮源中均生長良好，在氨氮和亞硝酸鹽氮的降解能力測定中氨氮和亞硝酸鹽氮的最大去除率可分別達(dá)94.1% 和99.24%。菌株ZH-14 對豬場沼液的處理效果較好，其較為合適的投菌量為終濃度107CFU/mL。