邱忠凱，譚淼，梁偉，丁全明，滿曉軍

(1本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪 117000；2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

近年來，我國前列腺癌(PCa)發(fā)病率和病死率有逐漸增高的趨勢(shì)，2015年我國男性PCa的發(fā)病率為6.03/1萬例，病死率為2.66/1萬例[1]，嚴(yán)重危害我國男性尤其是老年男性健康。晚期轉(zhuǎn)移性PCa及去勢(shì)抵抗PCa病死率較高，因而有必要進(jìn)一步研究PCa的病因及發(fā)生發(fā)展機(jī)制[2]。miRNA-34家族是不同物種間高度保守的家族，該家族成員包括miR-34a、miR-34b、miR-34c，miR-34a位于染色體1p36，而miR-34b和miR-34c位于11號(hào)染色體長臂2區(qū)3帶(11q23)。研究[3]表明，miR-34家族可通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)、c-Met等下游靶基因的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的作用。miR-34b和miR-34c為同源基因，但因靶基因的不同而發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用，miR-34b在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用還有待進(jìn)一步研究[4]。D型細(xì)胞周期蛋白家族由細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、D2、D3三種蛋白組成，具有調(diào)節(jié)增殖細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)變的作用。Cyclin D1過度表達(dá)主要與人類腫瘤發(fā)生和細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)，其異常表達(dá)在PCa、甲狀旁腺腺瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、黑色素瘤等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Cyclin D1的過表達(dá)使進(jìn)入S期的人前列腺癌細(xì)胞(LNCaP)數(shù)量增多，增加了腫瘤細(xì)胞集落形成和腫瘤生長速率[5]。目前，Cyclin D1、miR-34b在PCa中的調(diào)控機(jī)制及二者之間的關(guān)系尚不清楚，需進(jìn)一步深入研究。本研究通過檢測(cè)PCA組織中miR-34b、Cyclin D1 mRNA，分析兩者間及與PCA臨床病理特征的關(guān)系，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2015 年1月本溪市中心醫(yī)院收治的PCa患者57例，年齡56～79(67.54±7.80)歲，其中≤65歲24例、>65歲33例。所有患者為初次診斷，未接受其他治療，并排除其他惡性腫瘤。參照《中國泌尿外科疾病診斷治療指南》推薦的標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中Gleason評(píng)分≤6分25例、≥7分32例。臨床分期參照美國癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)PCa TNM分期系統(tǒng)[7]，其中Ⅰ～Ⅱ期 26例、Ⅲ～Ⅳ期31例。初始血清PSA≤10 ng/mL 9例，10～20 ng/mL 27例，>20 ng/mL 21例。所有患者術(shù)前均檢測(cè)血堿性磷酸酶、X線、MRI、核素骨掃描等檢查以明確有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中有轉(zhuǎn)移15例、無轉(zhuǎn)移42例。PCa組患者術(shù)后隨訪時(shí)間3～36個(gè)月，平均隨訪33.4個(gè)月，以門診或電子通訊方式，定期直腸指檢、血清總PSA、B超及MRI等檢查，隨訪至隨訪時(shí)間結(jié)束或患者死亡，隨訪截止時(shí)間2018年1月1日。另選43例BPH患者作對(duì)照，年齡57～79(69.57±6.92)歲。手術(shù)切取PCa組織及癌旁正常的前列腺組織各57例份(46例標(biāo)本行PCa根治術(shù)獲得，11例行經(jīng)尿道腫瘤電切獲得)及BPH組織43例份(行恥骨上前列腺摘除術(shù)獲得)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者知情同意并簽字。

1.2 組織中miR-34b、Cyclin D1 mRNA檢測(cè)方法 采用RT-PCR法。將剛離體的PCa組織、癌旁組織及BPH組織置于液氮速凍，后轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱保存。細(xì)胞中總RNA應(yīng)用TRIzol法提取。以3 μL總RNA為模板，用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件如下：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。miR-34b：5′-TTTTTATTTGTTTTGTTTTGTGTTTGTTTTG-3′，5′-CAACTACAACTCCCAAACAATCC-3′；內(nèi)參基因U6：5′-

GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，3′-CGCTTCACG-

AATTTGCGTGTCAT-5′；Cyclin D1：5′-GATACCAGAAGGGAAAGC-3′，5′-ATGCCTAGAACCCCACTA-3′。RT-PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中含1 μL cDNA，1 μL引物，8 μL Power SYBR Green Master Mix試劑、去離子純水。反應(yīng)條件為：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均在ABI7500 PCR儀上完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次。miRNA-34b及Cyclin D1反轉(zhuǎn)錄引物、PCR引物、探針、Power SYBR Green Master Mix試劑及ABI7500 RT-PCR儀均購自ABI生物公司。以2-ΔΔCt代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為ΔCt=Ct目的基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織。

2 結(jié)果

2.1 PCa和BPH組織中miR-34b、Cyclin D1 mRNA表達(dá)比較 PCa和BPH組織中miR-34b mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.57±0.35、1.24±0.48，Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.72±0.47、0.94±0.21，兩組比較，P均<0.05。

2.2 miR-34b、Cyclin D1表達(dá)與PCa臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果見表1。

2.3 PCa組織中miR-34b與Cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性 PCa組織中miR-34b與Cyclin D1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.517，P=0.013)。

表1 miR-34b、Cyclin D1表達(dá)與PCa患者臨床病理特征的關(guān)系

注：由表1可知，miR-34b、Cyclin D1表達(dá)均與Pca患者Gleason評(píng)分、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)。

2.4 組織中不同miR-34b、Cyclin D1表達(dá)患者3年總體生存率(OS)比較 所有PCa組織中miR-34b mRNA相對(duì)表達(dá)量以中位數(shù)(P50)0.562為臨界值，分為miR-34b高表達(dá)組24例，miR-34b低表達(dá)組33例；Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量以中位數(shù)(P50)2.705為臨界值，分為Cyclin D1高表達(dá)組31例和低Cyclin D1表達(dá)組26例。miR-34b高表達(dá)組、miR-34b低表達(dá)組3年OS分別為83.3%(20/24)、72.7%(24/33)，Cyclin D1高表達(dá)組、Cyclin D1低表達(dá)組3年OS分別為70.9%(22/31)、84.6%(22/26)，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

PCa是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來隨著人口老齡化及飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率有逐漸升高的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅男性健康。目前，PCa的治療包括手術(shù)、內(nèi)分泌治療及化療等，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性PCa患者的生存率較低。因此，深入研究其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制具有重要意義。

miRNA是非編碼的單鏈RNA分子，可通過與目的基因的mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，影響mRNA的穩(wěn)定性影響翻譯過程。在許多腫瘤如乳腺癌、肝癌等腫瘤均存在多種miRNA異常表達(dá)現(xiàn)象，參與腫瘤增殖、凋亡、分化等病理生理學(xué)過程，因此研究其表達(dá)有助于腫瘤的診斷、治療方式選擇及判斷預(yù)后[8]。miR-34基因位于23號(hào)染色體，在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中均表達(dá)下調(diào)，下調(diào)機(jī)制與基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化有關(guān)[9]。本研究顯示，PCa組織中miR-34b表達(dá)下調(diào)，此結(jié)果與以往研究[10]結(jié)果一致，機(jī)制可能與miR-34b基因位點(diǎn)11q23雜合性缺失有關(guān)，也可能與表觀遺傳學(xué)修飾后基因失活有關(guān)[11]。本研究還顯示，miR-34b表達(dá)與PCa病理分級(jí)、分期有關(guān)，機(jī)制可能與p53蛋白對(duì)miR-34表達(dá)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，p53基因突變及缺失多發(fā)生于高級(jí)別、進(jìn)展期PCa中[12]，p53基因異常表達(dá)引起miR-34表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而miR-34下游靶基因如Bcl-2、c-Met及Sox-2等功能改變，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移，而在低分期，低級(jí)別PCa中miR-34表達(dá)下降不明顯。此外，miR-34b高表達(dá)組患者3年總體生存較高，結(jié)果表明高表達(dá)miR-34b組患者預(yù)后較好，可能與miR-34b的抑癌作用有關(guān)。

在人類許多腫瘤均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白D基因擴(kuò)增以及其編碼的蛋白質(zhì)的過表達(dá)的現(xiàn)象，細(xì)胞周期蛋白表達(dá)或細(xì)胞周期蛋白激酶(CDK)活化的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的生物學(xué)特征的改變。Cyclin D1位于11q13，作為重要的周期素家族成員，參與G1/S期轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)過程。本研究顯示，PCa組織中Cyclin D1表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制可能與Cyclin D1原癌基因拷貝數(shù)目擴(kuò)增、基因突變有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，沉默Cyclin D1基因表達(dá)能抑制PCa細(xì)胞的增殖[13]，而Cyclin D1過表達(dá)促進(jìn)雄激素依賴性PCa細(xì)胞的增殖[14]。本研究還顯示，Cyclin D1表達(dá)與Pca病理分級(jí)、分期有關(guān)，機(jī)制可能是D型細(xì)胞周期蛋白(D1、D2和D3)的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)降解受生長因子激活和整合素衍生的黏附信號(hào)傳導(dǎo)影響，Cyclin D1高表達(dá)會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，所以增殖、分化和黏附信號(hào)與細(xì)胞周期進(jìn)程相統(tǒng)一的過程[15]。Cyclin D1在腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移過程中發(fā)揮重要作用，體外實(shí)驗(yàn)中Cyclin D1高表達(dá)可提高PCa細(xì)胞的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移能力[16]。此外，Cyclin D1高表達(dá)組患者3年OS較低，表明高Cyclin D1表達(dá)患者預(yù)后不良，可能與高表達(dá)組患者分期、分級(jí)較高有關(guān)。

多種miRNA如miR-195、MiR-218等能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中Cyclin D1基因表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡[17]。本研究顯示，PCa組織中miR-34b mRNA與Cyclin D1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與結(jié)果與以往對(duì)miR34研究結(jié)果一致，其相互作用的機(jī)制可能是miR-34能與Cyclin D1和E2、CDK4和6以及其他調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因的mRNA相互作用，調(diào)控細(xì)胞增殖過程，當(dāng)miR-34b表達(dá)降低時(shí)，腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間縮短，增殖加快。

總之，PCa組織中miR-34b及Cyclin D1 mRNA均存在異常表達(dá)現(xiàn)象，與PCa的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有希望成為PCa診斷、治療及評(píng)估預(yù)后的新的生物學(xué)標(biāo)志。