兔包皮來源的上皮細(xì)胞與人來源脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)(HAAM)組織工程共同培養(yǎng)細(xì)胞層片的體外研究

謝雪鋒 陳 剛 吳復(fù)躍 侯劍剛

(1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院泌尿外科 上海 201508; 2上海睿泰再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用研究院 上海 200040;3復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院泌尿外科 上海 200040)

尿道狹窄是泌尿外科臨床較為常見的一類疾病,手術(shù)的治療效果不甚理想,尤其是長段尿道狹窄。同時(shí)先天性尿道下裂、長段、超長段的尿道狹窄、閉鎖等畸形或創(chuàng)傷疾病都存在尿道缺損,需要再造尿道,這也是醫(yī)學(xué)界的治療難題[1]。自體組織替代技術(shù)雖然廣泛應(yīng)用,但需要患者付出巨大手術(shù)創(chuàng)傷代價(jià),仍深受質(zhì)疑。最明顯的不足之處在于需要額外手術(shù)來獲得移植材料,住院時(shí)間延長;取材部位可能會產(chǎn)生疼痛、感染等一系列并發(fā)癥;取材有限,患者不可避免受到二次創(chuàng)傷[2]。

我們的前期研究提示小塊兔尿道黏膜和包皮組織利用組織工程學(xué)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),能得到適用于長段尿道狹窄替代手術(shù)的片狀細(xì)胞層片,尤其是包皮組織來源的片狀細(xì)胞層生長快,具備一定的厚度、長度和張力[3],為進(jìn)一步研究組織工程尿道提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?？紤]到細(xì)胞層片在手術(shù)過程和之后的修復(fù)過程中容易破裂等因素,本研究在此基礎(chǔ)上探討包皮來源的上皮細(xì)胞與人來源脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)(human acellular amniotic membrane matrix,HAAM)共同培養(yǎng)形成細(xì)胞層片的效果,為臨床尿道重建尋找理想的修復(fù)替代材料。

材 料 和 方 法

試劑和儀器 MCDB153培養(yǎng)基、FBS (美國Sigma公司);青霉素/鏈霉素溶液、CellTrackerTMCM-Dil(美國Thermofisher公司);胰蛋白酶EDTA溶液、Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS,上海源培生物科技股份有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞刮棒(美國CORNING公司)。倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司);高速離心機(jī)、CO2恒溫培養(yǎng)箱,生物安全柜(美國Thermofisher公司)。

羊膜支架制備 羊膜的選材嚴(yán)格遵循供體醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn),取材獲取患者知情同意。在獲取健康剖腹產(chǎn)胎膜后,DPBS反復(fù)沖洗,鈍性分離羊膜與絨毛膜組織,去除羊膜基底面殘存的絨毛膜和血管組織。實(shí)驗(yàn)組用胰蛋白酶EDTA溶液消化新鮮羊膜上皮層的細(xì)胞,振蕩、清洗制成HAAM,甘油保存,以鈷60-γ射線照射滅菌(36 kGy)后備用。對照組將新鮮羊膜上皮面向上貼附在圓形細(xì)胞培養(yǎng)皿上,用細(xì)胞刮除器刮除羊膜上皮細(xì)胞,最后用DPBS清洗后備用(圖1)。

A:General amniotic membrane;B:Acellular amniotic membrane.Hematoxylin-eosin staining ×20.

圖1 人未脫細(xì)胞羊膜和脫細(xì)胞羊膜的組織形態(tài)學(xué)
Fig 1 Morphology of human general amniotic membrane and human acellular amniotic membrane

種子細(xì)胞制備 將冷凍保存的兔包皮細(xì)胞復(fù)蘇,培養(yǎng)。用CellTrackerTMCM-Dil標(biāo)記(37 ℃孵育5 min后,4 ℃孵育15 min)包皮細(xì)胞,生長至70%融合的包皮細(xì)胞以DPBS清洗2遍,加0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA的混合酶液,充分振蕩消化10 min后加入終止液,然后吸入離心管中,400×g離心5 min,去除上清液,留取細(xì)胞備用。

包皮細(xì)胞接種到羊膜上 將實(shí)驗(yàn)組和對照組羊膜上皮面向上貼附在圓形細(xì)胞培養(yǎng)皿上,用克隆環(huán)壓在羊膜上,將標(biāo)記的包皮細(xì)胞按1×105/cm2的密度分別接種于實(shí)驗(yàn)組和對照組羊膜上,置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中,每2天換液1次,4天后吸去培養(yǎng)液,用DPBS洗滌去除非黏附細(xì)胞,然后將羊膜經(jīng)甲醛固定、封片,行HE染色。然后通過組織學(xué)觀察上皮細(xì)胞及其在兩種基質(zhì)上的黏附及生長情況。

拉伸強(qiáng)度檢測 羊膜、HAAM、單純細(xì)胞層片、羊膜+細(xì)胞層片及HAAM+細(xì)胞層片共5組進(jìn)行拉力試驗(yàn)。將樣本裁為20 mm×50 mm 大小,使用拉力機(jī)(FR-108C,上海發(fā)瑞儀器科技有限公司)進(jìn)行樣本拉伸檢測,測試速度為10 mm/min,記錄樣本斷裂的最大力及拉伸強(qiáng)度。

結(jié) 果

包皮細(xì)胞在兩種羊膜基質(zhì)上均能正常生長,且兩種基質(zhì)所構(gòu)建的上皮組織學(xué)結(jié)構(gòu)相似。細(xì)胞呈單層生長,成熟上皮予以均勻覆蓋羊膜基質(zhì)表面,活細(xì)胞示蹤劑顯示細(xì)胞生長良好。共同培養(yǎng)4天后,倒置相差顯微鏡顯示,HAAM上和非羊膜部分的細(xì)胞生長良好;熒光顯微鏡顯示,生長在脫細(xì)胞羊膜的包皮細(xì)胞貼附良好,排列規(guī)則,形態(tài)規(guī)整,存活更多,更有優(yōu)勢(圖2～4)。HAAM作為基質(zhì)與上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)的細(xì)胞層片,力學(xué)強(qiáng)度優(yōu)于單純的細(xì)胞層片(表1)。

A:Control group;B:Experimental group.By inverted phase contrast microscope×100.

圖2 光鏡下兩組羊膜支架上的包皮上皮細(xì)胞
Fig 2 Foreskin-derived epithelial cells seeded on two groups of amniotic membrane scaffolds under microscope

A:Control group;B:Experimental group.By fluorescence microscope×100.

圖3 60 mm培養(yǎng)皿中CM-oil熒光標(biāo)記的兩組羊膜支架上的包皮上皮細(xì)胞
Fig 3 Foreskin-derived epithelial cells labled by CM-oil on two groups of amniotic membrane scaffolds in 60 mm dish (×100)

討 論

尿道下裂和不同原因引起的尿道狹窄閉鎖是泌尿外科常見疾病,由于缺乏理想的尿道修復(fù)替代材料,療效往往不佳,尤其是針對超過3 cm 的長段尿道狹窄往往采用自身組織進(jìn)行替代修補(bǔ),而無論應(yīng)用哪種手術(shù)方式,術(shù)后并發(fā)癥均嚴(yán)重影響治療效果[4]。處理長段尿道狹窄所面臨的主要問題就是尋找理想的修復(fù)替代材料[5]。組織工程技術(shù)發(fā)展為尿道修復(fù)帶來了新希望:將種子細(xì)胞在體外種植于天然的或人工合成的細(xì)胞外基質(zhì)上,經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后,將他們移植到體內(nèi),與自身尿道及周圍組織融合,以達(dá)到對受損尿道修復(fù)和重建的目的[6-7],其核心內(nèi)容是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象。我們的前期研究提示,利用組織工程學(xué)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)尿道黏膜和包皮細(xì)胞,能獲得較大面積的細(xì)胞層片,可以適用于長段尿道狹窄替代手術(shù)[3]。包皮來源的片狀細(xì)胞層生長快,且具備一定的厚度、長度和張力[3],為進(jìn)一步研究組織工程尿道層片提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但我們的后期研究提示,該細(xì)胞層片在動物實(shí)驗(yàn)中缺乏足夠的機(jī)械強(qiáng)度和厚度,修復(fù)結(jié)果不甚理想。因此我們期望通過一種支架材料來增強(qiáng)該細(xì)胞層片的強(qiáng)度、厚度和生長時(shí)間,為臨床提供更好的研究基礎(chǔ)。

A:Control group;B:Experimental group.Frozen section×100.

圖4 凍切片中熒光標(biāo)記的兩組羊膜支架上的包皮上皮細(xì)胞
Fig 4 Forskin-derived epithelial cells labled by CM-oil on two groups of amniotic membrane scaffolds in frozen section

表1 各組材料力學(xué)檢測
Tab 1 Mechanics testing of different materials groups

MaterialsMax(×10-2N)Tensile Strength (MPa)General amniotic membrane232.82±0.357.92±0.65Acellular amniotic membrane152.67±0.227.35±1.75Cell sheet5.65±0.500.44±0.23General amniotic membrane +Cell sheet235.45±0.427.96±1.03Acellular amniotic membrane +Cell sheet170.67±0.317.58±0.89

相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為HAAM是通過生物化學(xué)方法,去除組織中的羊膜上皮細(xì)胞和抗原成分,保留細(xì)胞羊膜基底膜與致密層組成的外基質(zhì)框架,其特殊的組織結(jié)構(gòu)利于細(xì)胞黏附和生長。作為一種天然的細(xì)胞外基質(zhì),良好的細(xì)胞載體材料,在脫除細(xì)胞成分后基質(zhì)無免疫原性,有望在組織器官體內(nèi)支撐引導(dǎo)種子細(xì)胞,并可負(fù)載細(xì)胞生長、增殖及分化[8]。我們把包皮細(xì)胞和羊膜共同培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)無論是在HAAM還是未脫細(xì)胞的羊膜上,包皮細(xì)胞都能生長良好,可以形成具有一定韌性、厚度和適當(dāng)大小的細(xì)胞層片(圖2、3)?？紤]到羊膜上的細(xì)胞具有異質(zhì)性,而脫細(xì)胞羊膜具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)良好的組織相容性;(2)生物可降解性;(3)無免疫原性;(4)多孔性和高空隙率,利于細(xì)胞的貼附和生長,誘導(dǎo)組織再生;(5)可塑性;(6)一定的機(jī)械強(qiáng)度[9]。范巨峰等[10]研究證實(shí)尿道黏膜上皮細(xì)胞在人脫細(xì)胞羊膜上共同培養(yǎng)后,細(xì)胞活性良好,所培養(yǎng)的細(xì)胞層生長效果良好。在本研究中,拉力試驗(yàn)顯示脫細(xì)胞羊膜的力學(xué)強(qiáng)度是下降的,共同培養(yǎng)上皮細(xì)胞后,實(shí)驗(yàn)組力學(xué)強(qiáng)度也略低于對照組,但是仍然遠(yuǎn)大于單純細(xì)胞層片,具備進(jìn)行縫合操作的條件。HAAM作為培養(yǎng)基質(zhì),包皮上皮細(xì)胞良好生長,且機(jī)械強(qiáng)度優(yōu)于單純的細(xì)胞層片,為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究提示利用組織工程技術(shù)可以培養(yǎng)出單層細(xì)胞層片,在此基礎(chǔ)上通過和HAAM共同培養(yǎng)可以得到更好的細(xì)胞層片。在HAAM上包皮細(xì)胞生長良好,與支架材料復(fù)合良好,并且具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和較大面積的細(xì)胞層片,為今后組織工程化尿道的復(fù)合階段研究提供了前期研究基礎(chǔ)。