詹 廳 李 晉 戴光云 張盛周

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蕪湖 241000)

黑斑蛙視網(wǎng)膜3種神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的免疫組織化學(xué)定位

詹 廳 李 晉 戴光云 張盛周＊

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蕪湖 241000)

目的 研究神經(jīng)肽 Y(NPY)、五羥色胺(5-HT)和胰高血糖素(GLU)免疫陽(yáng)性細(xì)胞在黑斑蛙(Rana nigromaculata)視網(wǎng)膜上的組織學(xué)定位。方法 應(yīng)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(SP法)免疫組織化學(xué)技術(shù),并結(jié)合生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 NPY細(xì)胞主要分布于內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層。內(nèi)核層中出現(xiàn)兩種陽(yáng)性細(xì)胞,一種出現(xiàn)在第2、3亞層,常為多個(gè)細(xì)胞聚集;另一種出現(xiàn)在內(nèi)側(cè),有突起伸入內(nèi)網(wǎng)層。節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性細(xì)胞分布較少,胞體有大小之分。5-HT細(xì)胞主要分布于內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層,位于內(nèi)核層中鄰近內(nèi)網(wǎng)層一側(cè)的陽(yáng)性細(xì)胞有突起延伸入內(nèi)網(wǎng)層。GLU細(xì)胞分布于外核層、內(nèi)核層內(nèi)側(cè)以及節(jié)細(xì)胞層。結(jié)論 黑斑蛙視網(wǎng)膜上NPY、5-HT和 GLU細(xì)胞的分布與其它物種有相似之處,也有其自身特點(diǎn),符合其晨昏性生活習(xí)性。

黑斑蛙;視網(wǎng)膜;神經(jīng)肽Y;5-羥色胺;胰高血糖素

神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(Neuroendocrine cells, NECs)是一類含神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)或神經(jīng)肽類激素的細(xì)胞,廣泛分布于機(jī)體各類器官組織中,參與多種調(diào)節(jié)作用[1]。研究表明,各類脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜中均存在多種神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞,但不同物種視網(wǎng)膜神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的分布、密度和形態(tài)均存在較大種間差異[2-12]。黑斑蛙(Rana nigromaculata)俗稱田雞,屬兩棲綱無(wú)尾目蛙科。在我國(guó)分布很廣,屬兩棲類的優(yōu)勢(shì)種群,具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,也是重要的科研和教學(xué)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。目前對(duì)黑斑蛙視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)已有研究[13],但其視網(wǎng)膜神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞方面的資料尚缺。本研究探討了神經(jīng)肽Y(NPY)、五羥色胺(5-HT)和胰高血糖素(GLU)細(xì)胞在黑斑蛙視網(wǎng)膜上的分布和形態(tài),旨在豐富比較內(nèi)分泌學(xué)知識(shí)體系,增進(jìn)對(duì)黑斑蛙視覺生理的認(rèn)識(shí),為該物種的生態(tài)保護(hù)和人工養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

材料和方法

1.材料

鮮活的成體黑斑蛙10只,采自蕪湖市市郊,重70-95g,雙毀髓后迅速取下完整眼球。整體Bouin’s液固定5-7d后,去除眼球前半部分,小心將視網(wǎng)膜撥出。常規(guī)脫水透明,石蠟包埋,切片(5-7μm),貼片。

2.主要試劑

神經(jīng)肽 Y(Neuropeptide Y,NPY)兔抗血清購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司,五羥色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)和胰高血糖素(Glucagon,GLU)兔抗血清為美國(guó)ZYMED公司產(chǎn)品。鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(Streptavidin Peroxidase,SP)免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。

3.免疫組織化學(xué)方法

常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2甲醇溶液孵育5min,消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。蒸餾水浸洗,PBS浸泡 5min,滴加正常山羊血清(1: 10)室溫孵育10min,封閉非特異性反應(yīng)部位。傾去血清,滴加一抗,4℃過(guò)夜。PBS浸洗3次× 5min,滴加即用型生物素標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG抗血清),室溫孵育1h。PBS浸洗3次×5min,滴加即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶,室溫1h。PBS浸洗 3次×5min,DAB-H2O2顯色,自來(lái)水洗凈,脫水,透明,封片。陰性對(duì)照分別用正常羊血清和PBS代替一抗,其余步驟同上。

4.觀察與計(jì)數(shù)

在德國(guó)萊卡DM2500型顯微鏡下觀察、拍照。免疫陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色,背景呈淺藍(lán)或淡黃色。對(duì)每例視網(wǎng)膜切片隨機(jī)取10個(gè)單位面積(100μm× 100μm)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),取平均值(±s)表示陽(yáng)性細(xì)胞的分布密度。用SPSS軟件獨(dú)立樣本 T檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析。

結(jié) 果

光學(xué)顯微鏡下,黑斑蛙視網(wǎng)膜具有典型的十層結(jié)構(gòu),由外向內(nèi)依次為色素上皮層、視桿視錐層、外膜層、外核層、外網(wǎng)層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層和內(nèi)膜層(圖 1)。視網(wǎng)膜上免疫陽(yáng)性細(xì)胞呈深棕色,背景呈淺藍(lán)或淡黃色,容易區(qū)分。

1.NPY細(xì)胞

NPY免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層,總體分布不均。內(nèi)核層陽(yáng)性細(xì)胞平均密度為39.5±13.7個(gè)/mm2,節(jié)細(xì)胞層為 5.5±2.5個(gè)/ mm2。兩層分布密度有顯著差異(P<0.05)。其中內(nèi)核層陽(yáng)性細(xì)胞可分為兩種類型,一種發(fā)生于內(nèi)核層的外側(cè)及第2、3亞層(S2、S3),常為2-3個(gè)圓形細(xì)胞聚集,胞體較小,直徑為5-10μm,陽(yáng)性較強(qiáng),胞體周圍有突起(圖2a)。另一種出現(xiàn)在內(nèi)核層中鄰近內(nèi)網(wǎng)層的一側(cè),呈圓形或卵圓形,胞體亦較小,陽(yáng)性較弱,并且多數(shù)胞體周圍有突起伸入內(nèi)網(wǎng)層的外側(cè)(圖 2b),形態(tài)上觀察為無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞。偶爾可見突起伸入內(nèi)網(wǎng)層第1亞層(S1)后再分出小分枝延伸至內(nèi)網(wǎng)層第3亞層(S3)(圖2b)。節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性細(xì)胞密度較小,細(xì)胞呈圓形,胞體有大小兩種,直徑分別為 10-12μm和 20-25μm,形態(tài)上可判斷為移位的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(圖2a,2b)。

2.5 -HT細(xì)胞

5-HT免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層,分布不均。內(nèi)核層平均密度為37.5±10.1個(gè)/mm2,節(jié)細(xì)胞層平均密度為 12.5±6.4個(gè)/ mm2,兩層分布密度有顯著差異(P<0.05)。內(nèi)核層陽(yáng)性細(xì)胞主要位于鄰近內(nèi)網(wǎng)層的一側(cè),胞體為圓形或橢圓形,胞外突起延伸入內(nèi)網(wǎng)層不同亞層。節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性細(xì)胞密度較小,細(xì)胞多呈圓形(圖3)。

3.GLU細(xì)胞

GLU免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要出現(xiàn)在外核層、內(nèi)核層內(nèi)側(cè)和節(jié)細(xì)胞層。外核層與內(nèi)核層陽(yáng)性細(xì)胞分布較均一,平均密度分別為 17.5±5.4個(gè)/mm2和31.2±7.4個(gè)/mm2;節(jié)細(xì)胞層數(shù)量較少,主要分布偏于中央?yún)^(qū)域,平均密度為7.5±3.2個(gè)/mm2。三層分布密度無(wú)顯著差異(P>0.05)。各層陽(yáng)性細(xì)胞多數(shù)呈圓形或橢圓形,其中內(nèi)核層陽(yáng)性細(xì)胞分布于內(nèi)側(cè),鄰近內(nèi)網(wǎng)層,胞外可見突起伸入內(nèi)網(wǎng)層;節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性細(xì)胞胞體較大,胞外有突起伸入內(nèi)網(wǎng)層(圖4)。

在內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層內(nèi)分別對(duì)以上3種免疫陽(yáng)性細(xì)胞的分布進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果顯示均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

討 論

脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜具有十層基本結(jié)構(gòu)。大多數(shù)動(dòng)物NPY細(xì)胞主要分布于內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層,如蜥蜴、小鼠、大鼠等[2-4],黑斑蛙與這些動(dòng)物相一致。不過(guò),人類視網(wǎng)膜中NPY免疫陽(yáng)性反應(yīng)多發(fā)生在網(wǎng)狀細(xì)胞層[5]。蟾蜍僅分布于內(nèi)核層,節(jié)細(xì)胞層未見[6]。牛蛙則除內(nèi)核層外,外核層亦有較強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng),且節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性細(xì)胞體積較小[7]。黑斑蛙外核層未發(fā)現(xiàn)有陽(yáng)性反應(yīng),且節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性細(xì)胞體積較大。黑斑蛙 NPY細(xì)胞密度遠(yuǎn)小于小鼠和大鼠[3,4],與蟾蜍相當(dāng)[6]。5-HT和 GLU在視網(wǎng)膜中的分布研究較少。雞視網(wǎng)膜5-HT細(xì)胞主要分布于內(nèi)核層,延伸入內(nèi)網(wǎng)層[8]。牛蛙視網(wǎng)膜5-HT細(xì)胞位于內(nèi)核層1/3外側(cè)端和最內(nèi)側(cè)[9]。本研究則發(fā)現(xiàn)黑斑蛙視網(wǎng)膜5-HT細(xì)胞主要集中于內(nèi)核層內(nèi)側(cè)。之前有研究顯示蛙類節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)網(wǎng)層中存在GLU細(xì)胞,未提及內(nèi)核層[10]。東方蠑螈 GLU細(xì)胞主要分布于網(wǎng)間細(xì)胞層,即一面有突起伸入外網(wǎng)層,另一面穿過(guò)內(nèi)核層伸入內(nèi)網(wǎng)層[11]。本研究顯示黑斑蛙GLU細(xì)胞主要出現(xiàn)在外核層和內(nèi)核層內(nèi)側(cè),節(jié)細(xì)胞層亦有少量分布。綜上可見,黑斑蛙視網(wǎng)膜NPY、5-HT和GLU細(xì)胞的分布與其它物種有相似之處,也有其自身特點(diǎn),具有明顯的種間特異性。

研究表明,黑斑蛙視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)與其晨昏性生活習(xí)性是相適應(yīng)的[13]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明NPY和5-HT參與了晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)[12,14],提示NPY和5-HT可能與動(dòng)物的晝行性與夜行性有關(guān)。黑斑蛙視網(wǎng)膜NPY和5-HT細(xì)胞的分布及密度與夜行性鼠類和晝行性人類均有較大差別,這種差異亦可能與其晨昏性生活習(xí)性有關(guān),有待進(jìn)一步的研究。

NPY在開始分析有結(jié)構(gòu)的視覺信息時(shí)出現(xiàn)表達(dá)峰值[15],暗適應(yīng)條件下雞視網(wǎng)膜中5-HT濃度增加[8],說(shuō)明NPY和5-HT與視覺形成有關(guān)。但本研究顯示NPY和5-HT并沒有分布于黑斑蛙視網(wǎng)膜感光層,推測(cè)其只是作為一種調(diào)節(jié)因子或神經(jīng)遞質(zhì),接收來(lái)自感光層的信號(hào)。5-HT可能在生物鐘中起神經(jīng)遞質(zhì)作用[14],NPY可以誘導(dǎo)5-HT在視網(wǎng)膜上的釋放[16]。GLU與視覺散焦有關(guān)[17],雞及本研究的黑斑蛙視網(wǎng)膜GLU細(xì)胞均在外核層中有分布,提示其可能參與了感光機(jī)能[18]。此外, GLU能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜上cAMP的形成[19],而NPY則能抑制其形成[15]。本研究顯示 GLU與NPY均在內(nèi)核層、節(jié)細(xì)胞層中有分布,推測(cè)二者可能是在內(nèi)核層及節(jié)細(xì)胞層內(nèi)通過(guò)雙向控制cAMP來(lái)共同調(diào)控視網(wǎng)膜的某些機(jī)能?？梢?NPY、5-HT和 GLU對(duì)視覺的形成均起著重要作用,并且三者之間關(guān)系密切,共同參與對(duì)視網(wǎng)膜功能的調(diào)節(jié)。

[1]胥維勇,楊群,范小莉.顯示神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的染色方法.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2006,15(1): 106-107

[2]Straznicky C,Hiscock J.Neuropeptide Y-immunoreactive neurons in the retina of two Australian lizards.Arch Histol Cytol,1994,57(2):151-160

[3]Sinclair J R,Nirenberg S.Characterization of neuropeptide Y-expressing cells in the mouse retina using immunohistochemical and transgenic techniques.J Comp Neurol,2001,432(3):296-306

[4]Oh SJ,D′Angelo I,Lee EJ,et al.Distribution and synaptic connectivity of neuropeptide Y-immunoreactive amacrine cells in the rat retina.J Comp Neurol,2002,446(3):219-234

[5]Tornqvist K,Ehinger B.Peptide immunoreactive neurons in the human retina.Invest Ophthalmol Vis Sci, 1988,29(5):680-686

[6]李雯,李海標(biāo),許天祿.神經(jīng)肽 Y樣免疫反應(yīng)神經(jīng)元在蟾蜍視網(wǎng)膜的定位與分布.廣東解剖學(xué)通報(bào),1993, 15(1):51-55

[7]趙霞.牛蛙視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)肽 Y的免疫組織化學(xué)研究.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(20):2084-2087

[8]Fosser N S,Brusco A,Rios H,et al.Darkness induced neuroplastic changes in the serotoninergic systeme of the chick retina.Brain Res Dev Brain Res,2005,160(2): 211-218

[9]蘇克儉,魏華.視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞5-HT免疫組織化學(xué)研究.青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,21(2):3-4

[10]TornqvistK,Ehinger B.Glucagon immunoreactive neurons in the retina of different species.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,1983,220(1):1-5

[11]Negishi K,Shinagawa S,Ushijima M,et al.An immunohistochemical study of regenerating newt retinas.Brain Res Dev Brain Res,1992,68(2):255-264

[12]Goel N,Lee TM,Smale L.Suprachiasmatic nucleus and intergeniculate leaflet in the diurnal rodent Octodon degus:retinal projections and immunocytochemical characterization.Neuroscience,1999,92:1491-1509

[13]吳奇久,李俊鳳,肖悅梅.青蛙視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)及分布特點(diǎn)的研究.動(dòng)物學(xué)報(bào),1980,26(1):10-16

[14]Rodriguez Sosa L,Calderon Rosete G,Flores G.Circadian and ultradian rhythms in the crayfish caudal photoreceptor.Synapse,2008,62(9):643-652

[15]Bagnoli P,Dal Monte M,Casini G.Expression of neuropeptides and their receptors in the developing retina of mammals.HistolHistopathol,2003,18(4): 1219-1242

[16]Bruun A,Ehinger B.NPY-induced neurotransmitter release from the rabbit and chicken retina.Acta Ophthalmol(Copenh),1993,71(5):590-596

[17]Mathis U,Schaeffel F.Glucagon-related peptides in the mouse retina and the effects of deprivation of form vision.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2007,245(2):267-275

[18]Fischer A J,Skorupa D,Schonberg D L,et al.Characterization ofglucagon-expressing neurons in the chicken retina.J Comp Neurol,2006,496(4):479-494

[19]Schorderet M,Sovilla J Y,Magistretti P J.VIP-and glucagon-induced formation of cyclic AMP in intact retinae in vitro.Eur J Pharmacol,1981,71(1): 131-133

圖 版 說(shuō) 明

圖1 視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu),示視網(wǎng)膜10層結(jié)構(gòu)。PE:色素上皮層;RCL:視桿視錐層;OLM:外界膜;ONL:外核層;OPL:外網(wǎng)層;INL:內(nèi)核層;IPL:內(nèi)網(wǎng)層;GCL:節(jié)細(xì)胞層;NFL:神經(jīng)纖維層;ILM:內(nèi)界膜。HE染色,標(biāo)尺=50μm。

圖2 NPY陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層。內(nèi)核層中出現(xiàn)兩種陽(yáng)性細(xì)胞,一種為多個(gè)細(xì)胞聚集(圖2a,↑↑),另一種出現(xiàn)在內(nèi)核層內(nèi)側(cè),有突起伸入內(nèi)網(wǎng)層(圖2a,2b,▲),有些突起伸入內(nèi)網(wǎng)層 S3(圖2b,△△);節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性細(xì)胞分布較少,胞體有大小兩種(圖2a,小胞體;圖2b,大胞體;↑)。SP法,標(biāo)尺=50μm。

圖3 5-HT陽(yáng)性細(xì)胞分布于內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層。分布于內(nèi)核層中鄰近內(nèi)網(wǎng)層一側(cè)有突起伸入內(nèi)網(wǎng)層(▲)。節(jié)細(xì)胞層有少量分布(↑)。SP法,標(biāo)尺=50μm

圖4 GLU陽(yáng)性細(xì)胞分布于外核層(△)、內(nèi)核層(▲)和節(jié)細(xì)胞層(↑)。內(nèi)核層有突起伸入內(nèi)網(wǎng)層。SP法,標(biāo)尺=50μm。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The histological structure of the retina ofRana nigromaculata,showing 10 layers structure.PE:Pigment epithelia layer;RCL:Cones and rods layer;OLM:Outer limiting membrane;ONL:Outer nuclear layer;OPL:Outer plexiform layer;INL:Innernuclearlayer;IPL:Innerplexiform layer;GCL:Ganglion cell layer;NFL:Nerve fibers layer;ILM:Inner limiting membrane.HE staining, Scale=50μm.

Fig.2 NPY positive cells are localized in INLand GCL.There are two types of cells in the INL.The cells of one type are usually collected each other(2a,↑↑).The other type is found in the inner part of the INLwith the processes ramified into IPL(2a,2b,▲),while some ramified into S3 ofIPL(2b,△△).Less cells are found in the GCLwith small or large cell bodies(2a,small,↑;2b,larger,↑).SP method,Scale=50μm.

Fig.3 5-HT positive cells are present in INLand GCL.The cells in the INLare close to INL/IPLborder with their processes to the IPL(▲).Less cells are found in the GCL(↑).SP method,Scale=50μm.

Fig.4 GLU positive cells are localized in ONL(△),INL(▲)and GCL(↑).In the INL,their processes are ramified into the IPL.SP method,Scale = 50μm.

IMMUNOHISTOCHEMICALLOCALIZATION OF THREE TYPES OF NEUROENDOCRINE CELLS IN THE RETINA OFRANA NIGROMACULATA

Zhan Ting,Li Jin,Dai Guangyun,Zhang Shengzhou＊
(College of Life Science,Anhui Normal University,Wuhu241000,China)

Objective To investigate the histological localization of neuropeptide Y(NPY),5-hydroxytryptamine(5-HT)and glucagon(GLU)immunohistochemical positive cells in the retina ofRana nigromaculata.Methods Streptavidin peroxidase(SP)immunohistochemical method was used with biological statistical analysis.Results NPY cells were mainly localized in the inner nuclear layer(INL)and the ganglion cell layer(GCL).Two types of cells were found in the INL.One lay in strata 2 and 3(S2, S3),usually in clusters.The other was in the inner part of the INL,with their processes ramified into the inner plexiform layer(IPL).In the GCL,the positive cells were scattered with different sizes.The 5-HT cells were present in the INLand GCL.The cells in the INLclose to the INL/IPLborder extended their processes to the IPL.GLU cells were localized in the outer nuclear layer(ONL),INLand GCL.These cells in the INLand GCLhad their processes ramified into the plexiform layer.Conclusion Compared with other animals,there are both common and specific features in the distribution of NPY,5-HT and GLU cells in the retina ofRana nigromaculata,which is in accordance with its twilight habit.

Rana nigromaculata;Retina;Neuropeptide Y;5-Hydroxytryptamine;Glucagon

R329.3

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.009

2010-03-22

2010-06-07

安徽師范大學(xué)生物大分子進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(2006B001),"動(dòng)物生物學(xué)"安徽師范大學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)基金,生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)基金資助

詹廳,女(1984年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)