田浩 康曉艷 楊琳 朱海波 郭偉 宋霞

肺癌是人類最常見(jiàn)的導(dǎo)致死亡的癌癥之一［1］，其中小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）約占肺癌總數(shù)的15%［2］。SCLC患者目前主要的治療方案為全身化療［3］。有研究表明程序性死亡受體1（pro-grammed death 1，PD-1）及其配體程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）在腫瘤組織中表達(dá)異位上調(diào)［4］。該通路能減弱T細(xì)胞的活化并抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答［5］。因此，PD-1/PD-L1通路作為新的免疫治療靶點(diǎn)，其抑制劑已經(jīng)被用于治療多種腫瘤包括SCLC。有研究發(fā)現(xiàn)［6］，可溶性程序性死亡配體1（soluble programmed death ligand 1，sPD-L1）在化療前后肺癌患者外周血變化與疾病進(jìn)展相關(guān)，但此項(xiàng)研究?jī)H包括鱗癌、腺癌患者，sPD-L1在SCLC患者中的變化尚未得到充分研究。本研究旨在評(píng)價(jià)sPD-L1在SCLC患者表達(dá)水平，分析其在不同療效中的變化趨勢(shì)、以及與腫瘤標(biāo)志物胃泌素釋放肽前體（pro gastrin releasing peptide，ProGRP）相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

篩選2018年3月至2018年11月山西省腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為SCLC的初治患者94例作為試驗(yàn)組，其中男性72例、女性22例，年齡（28～82）歲；選取健康體檢者17例作為對(duì)照組，其中男性10例、女性7例，年齡（26～83）歲。兩組性別及年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所選患者有完整的病歷資料，包括性別、年齡、吸煙狀況、病理類型、腫瘤TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況。通過(guò)94例SCLC患者治療前、后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血漿sPD-L1水平，觀察其與療效的相關(guān)性；檢測(cè)17例健康體檢者sPD-L1水平。

1.2 方法

1.2.1 化療方案 肺癌患者使用化療方案：順鉑+依托泊甙（EP）、卡鉑+依托泊甙（CE）全身化療4個(gè)周期，化療期間采外周血3 mL/次，在30 min內(nèi)將外周血2 000 r/min離心10 min，取初上清液并在-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo) 利用細(xì)胞程序性死亡蛋白1配體1（PDCD1LG1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生云克隆科技股份有限公司。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450。sPD-L1Ig濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 療效評(píng)價(jià) 按照2009年版實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）評(píng)價(jià)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的療效，分為疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）組、部分緩解（partial response，PR）組和疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）組，分析患者治療前后sPD-L1水平與臨床療效的相關(guān)性。

1.2.4 受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析 可溶性程序性死亡配體1（sPD-L1）以特異性為橫坐標(biāo)，敏感性為縱坐標(biāo)作ROC曲線，觀察sPD-L1曲線下面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 sPD-L1標(biāo)準(zhǔn)曲線

sPD-L1濃度與 OD450值之間的線性關(guān)系（r2=0.96，圖1）。

2.2 sPD-L1測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)組外周血sPD-L1水平為（1.59±1.02）ng/mL，對(duì)照組為（0.67±0.21）ng/mL；試驗(yàn)組外周血sPD-L1水平高于對(duì)照組（P＜0.01，圖2）。

2.3 治療過(guò)程中外周血中sPD-L1水平的變化

SCLC患者接受全身化療，比較PR組、PD組和SD組化療過(guò)程中sPD-L1水平變化。PR組和PD組化療前后sPD-L1含量的均值差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01，表1）。SD組化療前后sPD-L1含量無(wú)顯著性差異（表1）。

2.4 治療前后外周血中ProGRP水平的變化

SCLC患者接受全身化療，比較PR組、PD組和SD組化療過(guò)程中ProGRP水平變化。PR組和PD組化療前后ProGRP含量的均值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01，表2）；SD組化療前后ProGRP含量無(wú)顯著性差異。

圖1 sPD-L1濃度與OD450值之間線性關(guān)系

圖2 外周血sPD-L1表達(dá)水平

2.5 SCLC患者治療期間sPD-L1變化趨勢(shì)

PR組患者sPD-L1動(dòng)態(tài)變化呈下降趨勢(shì)；PD組患者sPD-L1動(dòng)態(tài)變化呈上升趨勢(shì)；SD組患者sPD-L1動(dòng)態(tài)變化較平穩(wěn)（圖3）。

表1 SCLC患者化療過(guò)程中外周血中sPD-L1水平的變化

表2 SCLC患者化療前后外周血中ProGRP水平的變化

圖3 SCLC患者治療期間sPD-L1變化趨勢(shì)

2.6 小細(xì)胞肺癌患者治療期間ProGRP變化趨勢(shì)

PR組患者ProGRP動(dòng)態(tài)變化呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；PD組患者ProGRP動(dòng)態(tài)變化呈上升趨勢(shì)；SD組患者ProGRP動(dòng)態(tài)變化較平穩(wěn)（圖4）。

圖4 SCLC患者治療期間ProGRP變化趨勢(shì)

2.7 相關(guān)性分析

sPD-L1與SCLC患者臨床特征的相關(guān)性分析，根據(jù)本研究結(jié)果中SCLC患者的中位sPD-L1水平，將其分為sPD-L1高表達(dá)組（≥2.14 ng/mL）及低表達(dá)組（＜2.14 ng/mL）。SCLC患者sPD-L1表達(dá)與性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟或腦轉(zhuǎn)移差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表3）。

表3 sPD-L1與SCLC患者臨床特征的相關(guān)性

2.8 臨床評(píng)價(jià)

以SCLC患者和健康對(duì)照組sPD-L1水平進(jìn)行ROC曲線分析。以特異性為橫坐標(biāo)，敏感性為縱坐標(biāo)作ROC曲線。ROC曲線下的面積為sPD-L1：0.94（95%CI：0.89～0.99，P＜0.01）；按照最佳臨界點(diǎn)選擇的原則，sPD-L1為1.36 ng/mL時(shí)，為最佳臨界點(diǎn)，此時(shí)sPD-L1的靈敏度為95.0%，特異性為79.62%，陽(yáng)性似然比為4.66。

3 討論

免疫治療目前已成為治療腫瘤除手術(shù)、化療、放療以及靶向治療之外的重要手段。SCLC具有惡性程度高、侵襲性強(qiáng)和易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，主要治療方法為放化療。PD-1/PD-L1通路阻滯抑制劑聯(lián)合化療在臨床研究中取得了顯著的療效［7-8］，其潛在增效機(jī)制尚在探討，其也成為近20年來(lái)SCLC治療新的突破點(diǎn)。體內(nèi)免疫系統(tǒng)中PD-L1以兩種形式存在，細(xì)胞膜型（mPD-L1）和sPD-L1。有研究發(fā)現(xiàn)［9］，PD-L1表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞系上清中可以檢測(cè)到高濃度的sPD-L1，而且sPD-L1的含量與mPD-L1的表達(dá)強(qiáng)度有關(guān)，由此推測(cè)sPD-L1是mPD-L1剪切形成的，并且兩者的生物學(xué)功能相似［10］，且都可以與T細(xì)胞表面PD-1受體結(jié)合，導(dǎo)致T細(xì)胞失活，負(fù)向調(diào)控免疫系統(tǒng)［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組sPD-L1水平顯著高于對(duì)照組，提示sPD-L1在SCLC患者中高表達(dá)。比較患者化療期間sPD-L1的動(dòng)態(tài)變化，PR組患者sPD-L1水平呈下降趨勢(shì)，PD患者sPD-L1水平呈上升趨勢(shì)，SD組患者sPD-L1水平波動(dòng)幅度相對(duì)較小。導(dǎo)致趨勢(shì)不同的原因可能是患者體內(nèi)sPD-L1表達(dá)水平與對(duì)T細(xì)胞的抑制作用成正比，抑制后失活的T細(xì)胞無(wú)法清除腫瘤細(xì)胞，使其逃避免疫監(jiān)視從而更容易的進(jìn)行組織浸潤(rùn)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。有研究提示［12］，sPD-L1的表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、腹部的臟器轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)。而本研究中分析試驗(yàn)組sPD-L1表達(dá)與性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟或腦轉(zhuǎn)移差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。血漿sPD-L1在SCLC患者中高表達(dá)，但具體的人群特征尚不明確，需要進(jìn)一步的大樣本及分層因素更加均衡樣本加以驗(yàn)證。

依據(jù)本研究結(jié)果，在sPD-L1為1.36 ng/mL時(shí)，可能為最佳臨界點(diǎn)，提示血漿sPD-L1在反映SCLC腫瘤負(fù)荷方面有較高的特異性和靈敏度。有研究顯示［13］，sPDL1濃度升高可作為SCLC化療患者預(yù)后不良的潛在指標(biāo)。ProGRP對(duì)于SCLC患者的預(yù)后判斷有較高價(jià)值［14］，本研究對(duì)比了sPD-L1和ProGRP在SCLC患者病情進(jìn)展，部分緩解和穩(wěn)定期間的變化幅度基本一致。提示sPD-L1在評(píng)估SCLC腫瘤負(fù)荷方面的作用和腫瘤標(biāo)志物ProGRP接近。

SCLC治療方法近20年來(lái)無(wú)新突破，主要治療方法為放化療。PD-1/PD-L1通路阻滯抑制劑有望成為新的突破點(diǎn)，其中nivolumab的CheckMate 032研究［15］，pembrolizumab 的 KEYNOTE 158 研究［16］，以及atezolizumab的IMpower 133研究［17］均在SCLC治療方面取得重大進(jìn)展。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)［18］，在NSCLC中組織PD-L1腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性比例分?jǐn)?shù)（tumor proportion score，TPS）水平更高的患者客觀緩解率和無(wú)進(jìn)展生存期獲益更為顯著，而且總生存期呈獲益趨勢(shì)。有研究提示［19］，96例SCLC患者中PD-L1 TPS表達(dá)＜1%的例數(shù)占83.9%，≥50%的例數(shù)占1.1%。

在SCLC免疫治療CheckMate 032研究［15］中組織PD-L1 TPS表達(dá)與腫瘤反應(yīng)無(wú)顯著相關(guān)性，而在KEYNOTE 028研究［20］以及KEYNOTE 158研究中組織PD-L1陽(yáng)性聯(lián)合分?jǐn)?shù)（combined positive score，CPS）表達(dá)較高的SCLC患者免疫治療獲益更大。CPS不局限于TPS僅計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)，包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞等PD-L1表達(dá)，說(shuō)明SCLC對(duì)于細(xì)胞PD-L1表達(dá)總量的水平可能更加敏感。然而組織樣本檢測(cè)，存在臨床預(yù)測(cè)效果不一致、無(wú)法兼顧腫瘤的異質(zhì)性、治療等干預(yù)因素的影響、檢測(cè)可重復(fù)性差以及難以同時(shí)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的表達(dá)量等因素。組織中PD-L1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)難以成為精準(zhǔn)選擇免疫治療獲益人群最好的可動(dòng)態(tài)觀察的預(yù)測(cè)性指標(biāo)。相對(duì)于組織標(biāo)本，血漿檢測(cè)可在一定程度上均質(zhì)腫瘤的異質(zhì)性，更客觀地反映腫瘤的實(shí)際情況，且在臨床中取材相對(duì)簡(jiǎn)便，能夠動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察指標(biāo)的變化。隨著PD-1/PD-L1通路阻滯抑制在臨床上的廣泛應(yīng)用，篩選準(zhǔn)確且便于觀察的生物標(biāo)志物的需求也更加迫切，sPD-L1潛在的應(yīng)用價(jià)值逐漸被關(guān)注。