薛梅 張德利 刁慶春 涂彩霞 林茂

[摘要]目的：研究丹參酚酸B對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的人表皮黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的保護(hù)作用。方法：采用MTT法檢測H2O2對黑素細(xì)胞的活力抑制作用及丹參酚酸B的保護(hù)作用;Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測H2O2誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡的作用及丹參酚酸B的保護(hù)作用;DCFH-DA法流式細(xì)胞術(shù)檢測H2O2促進(jìn)黑素細(xì)胞活性氧簇（ROS）生成的作用及丹參酚酸B的抗氧化效果。結(jié)果：250μmol/L H2O2作用于黑素細(xì)胞24h可明顯降低細(xì)胞活力、增加凋亡。0.6～10μmol/L丹參酚酸B預(yù)處理1h可明顯保護(hù)黑素細(xì)胞，減少H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞活力降低及凋亡。H2O2作用2h可顯著誘導(dǎo)ROS生成，而丹參酚酸B可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS生成。結(jié)論：丹參酚酸B可能抑制活性氧生成，減少H2O2引起的黑素細(xì)胞凋亡，因而可能具有成為治療白癜風(fēng)新藥的前景。

[關(guān)鍵詞]丹參酚酸B;過氧化氫;黑素細(xì)胞;凋亡;氧化應(yīng)激;白癜風(fēng)

[中圖分類號]R329.2+8? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）06-0064-03

Abstract： Objective? To test the effects of magnesium tanshinoate B on H2O2-induced oxidative stress and apoptosis in human epidermal melanocytes. Methods? Effects of H2O2 and magnesium tanshinoate B on cell viability were tested by MTT assay. The apoptosis of melanocytes were detected by annexin-V/PI staining cytometry analysis. ROS generation was measured by cytometry analysis with DCFH-DA method. Results? The cell viability of melanocytes deceased and apoptosis rate and ROS generation increased after treated with 250μmol/L H2O2 for 24h， while pretreatment with 0.6～10μmol/L magnesium tanshinoate B significantly alleviated the effects of H2O2.? Conclusions? Magnesium tanshinoate B alleviated H2O2-induced apoptosis in melanocytes probably by inhibiting the ROS generation according to its antioxidant ability， thus may have the potential to be used in treating vitiligo in the future.

Key words： magnesium tanshinoate B; H2O2; melanocyte; apoptosis; oxidative stress; vitiligo

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性疾病，以黑素細(xì)胞缺失為主要特征，全球發(fā)病率約為0.5%～2%，嚴(yán)重影響患者身心健康[1]。本病發(fā)病機(jī)制尚不明確，但近年來氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的作用越來越得到重視，氧化應(yīng)激可能是引起白癜風(fēng)黑素細(xì)胞死亡的重要原因[2]。因此，尋找有效的抗氧化劑成為治療白癜風(fēng)新的研究方向[3-4]。

丹參酚酸B（Magnesium tanshinoate B，MTB）是中藥丹參的有效成分之一，來源于唇形科植物丹參Salvia Miltiorrhiza Bge.的根及根莖，具有很強(qiáng)的抗氧化作用。近年體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，丹參酚酸B具有強(qiáng)大的抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、清除氧自由基的作用，是目前已知最強(qiáng)的天然抗氧化產(chǎn)物之一[5]。但對于氧化應(yīng)激引起的黑素細(xì)胞凋亡，丹參酚酸B是否也具有保護(hù)作用，目前尚不清楚。本研究利用過氧化氫誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡，來檢測丹參酚酸B抗黑素細(xì)胞活性氧簇生成的作用，以及抑制黑素細(xì)胞凋亡的作用。

1? 材料和方法

1.1 主要儀器及試劑：細(xì)胞系：人表皮黑素細(xì)胞株-中色素（HEM-m，美國sciencell公司）。主要試劑：丹參酚酸B（Magnesium tanshinoate B，南京森貝伽生物科技有限公司，中國）、30%過氧化氫（H2O2，Sigma，美國）、N-乙酰半胱氨酸（acetylcysteine，NAC，Sigma，美國）、胰蛋白酶（Gibico，美國）、乙二胺四乙酸（EDTA，Sigma，美國）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Sigma，美國）、二甲基亞砜（DMSO）、2'，7'-二氯氫化熒光素探針（DCF-DA，Sigma，美國）、TACS Annexin-V-FITC試劑盒（Trevigen，美國）、M254培養(yǎng)基及補(bǔ)充物（Cascade，美國）。主要儀器：自動酶標(biāo)儀（Thermo，芬蘭）、倒置顯微鏡（Nikon，日本）、流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑素細(xì)胞培養(yǎng)：人表皮黑素細(xì)胞株復(fù)蘇后，以5×105/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，以M254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，取第2～5代進(jìn)入對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行以下實驗[3，6]。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測：采用四甲基偶氮唑藍(lán)色法（MTT法）。以不同濃度的丹參酚酸B作為試驗組，10mmol/L的NAC作為陽性對照組，只加H2O2為陰性對照組，不加任何藥物處理作為空白對照組。黑素細(xì)胞以1×105個/ml濃度接種于96孔板，每孔加細(xì)胞懸液100μl，每組設(shè)3個復(fù)孔，過夜貼壁后，首先測定丹參酚酸B的安全濃度，不同濃度的丹參酚酸B作用于黑素細(xì)胞24h，每孔加5mg/ml MTT溶液20μl，培養(yǎng)4h后，棄上清，加100μl DMSO低速震蕩5min，以波長490nm酶標(biāo)儀測定吸光度值[6]。計算出安全濃度范圍后，加入丹參酚酸B或NAC預(yù)處理1h，再加入250μmol/L的H2O2，37℃孵箱作用24h。

1.2.3 Annexin-V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測：細(xì)胞分組及處理同上。按TACS Annexin-V-FITC試劑盒說明操作，培養(yǎng)細(xì)胞消化、離心，每個樣本加入FITC熒光標(biāo)記的Annexin-V和PI各10μl，室溫避光孵育10min，PBS洗3遍，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測Annexin-V和PI陽性細(xì)胞比例[6]。

1.2.4 DCF-DA法活性氧簇含量檢測：培養(yǎng)的黑素細(xì)胞加入10μmol/L丹參酚酸B或10mmol/L的NAC預(yù)處理1h，再加入250μmol/L的H2O2作用24h，空白對照組及陰性對照組處理同上。再加入10μmol/L DCF-DA，37℃孵箱中孵育30min，消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗3次，波長488/525nm流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測熒光強(qiáng)度[6]。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)以（x?±s）表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用單因素方差分析。

2? 結(jié)果

2.1 丹參酚酸B減少H2O2引起的黑素細(xì)胞活力降低：不同濃度的丹參酚酸B作用于黑素細(xì)胞24h，當(dāng)濃度≥20μmol/L時，細(xì)胞活力明顯低于空白對照組（見圖1），故選擇≤10μmol/L濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。250μmol/L的H2O2作用于黑素細(xì)胞24h，可明顯減少細(xì)胞活力。0.6～10μmol/L丹參酚酸B預(yù)處理1h可呈濃度依賴性增加細(xì)胞活力，抑制H2O2引起的黑素細(xì)胞死亡，0.3μmol/L的丹參酚酸B則無明顯保護(hù)作用（見圖2）。

2.2 丹參酚酸B減少H2O2引起的黑素細(xì)胞凋亡：250μmol/L的H2O2作用于黑素細(xì)胞24h，可顯著誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡。0.6～10μmol/L丹參酚酸B預(yù)處理1h可呈濃度依賴性減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。見圖3。

2.3 丹參酚酸B抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS生成：250μmol/L的H2O2作用于黑素細(xì)胞2h，可顯著誘導(dǎo)黑素細(xì)胞ROS生成。10μmol/L丹參酚酸B預(yù)處理1h可明顯抑制H2O2誘導(dǎo)ROS生成。見圖4。

3? 討論

有多項證據(jù)表明白癜風(fēng)患者存在明顯的氧化應(yīng)激表現(xiàn)。進(jìn)展期白癜風(fēng)患者表皮中H2O2水平顯著升高，部分抗氧化酶水平低于正常[6-8]。皮損邊緣及非皮損區(qū)表皮細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，活性氧簇（ROS）含量也高于正常[2，6，9]，患者外周血中也存在多種抗氧化酶的失衡[6，10-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)皮損及邊緣存在黑素細(xì)胞凋亡[1，6]，而氧化應(yīng)激可能是引起黑素細(xì)胞凋亡的重要原因[2，6]。而體外實驗也證明H2O2可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡[4，6]。因此，本研究利用這一模型來檢測抗氧化劑對黑素細(xì)胞的保護(hù)作用，篩選可能對白癜風(fēng)治療有效的抗氧化劑。研究結(jié)果表明：250μmol/L的H2O2可明顯增加黑素細(xì)胞ROS含量，減少細(xì)胞活力，誘導(dǎo)凋亡。這些結(jié)果說明H2O2可穩(wěn)定地激活黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)其凋亡，可以作為白癜風(fēng)抗氧化藥物篩選的細(xì)胞模型[6]。

丹參酚酸B具有兩個羧基，是由3分子的丹參素和1分子的咖啡酸縮合而成，具有強(qiáng)大的體內(nèi)及體外抗氧化作用，既往研究顯示其對心肌缺血再灌注損傷具有良好的保護(hù)作用[5]。因此，筆者推測丹參酚酸B也可能具有抗氧化應(yīng)激，減少黑素細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示：0.6～10μmol/L丹參酚酸B預(yù)處理1h可呈濃度依賴性減少H2O2引起的黑素細(xì)胞活力降低，減少黑素細(xì)胞凋亡。此外，研究結(jié)果還顯示：丹參酚酸B可明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞ROS生成，抑制氧化應(yīng)激，提示抗凋亡作用可能與其抗氧化作用相關(guān)。

綜上所述，丹參酚酸B可能通過抗氧化抑制H2O2引起的黑素細(xì)胞凋亡，因而可能具有開發(fā)成為治療白癜風(fēng)新藥的前景，其作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Huang CL，Nordlund JJ，Boissy R.Vitiligo：a manifestation of apoptosis？[J].Am J Clin Dermatol，2002，3（5）：301-308.

[2]Speeckaert R，Dugardin J，Lambert J，et al.Critical appraisal of the oxidative stress pathway in vitiligo：a systematic review and meta-analysis[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2018，32（7）：1089-1098.

[3]Ma J，Li S，Zhu L，et al.Baicalein protects human vitiligo melanocytes from oxidative stress through activation of NF-E2-related factor2 （Nrf2） signaling pathway[J].Free Radic Biol Med.2018，129：492-503.

[4]Lu W，Zhao Y，Kong Y，et al.Geniposide prevents H2O2 -induced oxidative damage in melanocytes by activating the PI3K-Akt signalling pathway[J].Clin Exp Dermatol，2018，43（6）：667-674.

[5]Leung SW，Zhu DY，Man RY.Effects of the aqueous extract of Salvia Miltiorrhiza （danshen） and its magnesium tanshinoate B-enriched form on blood pressure[J].Phytother Res，2010，24（5）：769-774.

[6]林茂，盧珊珊，張?zhí)N穎，等.芹黃素對過氧化氫引起的黑素細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2011，25（8）：583-586.

[7]Schallreuter KU，Wood JM，Berger J.Low catalase levels in the epidermis of patients with vitiligo[J].J Invest Dermatol，1991，97（6）：1081-1085.

[8]Schallreuter KU，Moore J，Wood JM，et al.In vivo and in vitro evidence for hydrogen peroxide （H2O2） accumulation in the epidermis of patients with vitiligo and its successful removal by a UVB-activated pseudocatalase[J].J Investig Dermatol Symp Proc，1999，4（1）：91-96.

[9]Prignano F，Pescitelli L，Becatti M，et al.Ultrastructural and functional alterations of mitochondria in perilesional vitiligo skin[J].J Dermatol Sci，2009，54（3）：157-167.

[10]Koca R，Armutcu F，Altinyazar HC，et al.Oxidant-antioxidant enzymes and lipid peroxidation in generalized vitiligo[J].Clin Exp Dermatol，2004，29（4）：406-409.

[11]Schallreuter KU，Chiuchiarelli G，Cemeli E，et al.Estrogens can contribute to hydrogen peroxide generation and quinone-mediated DNA damage in peripheral blood lymphocytes from patients with vitiligo[J].J Invest Dermatol，2006，126（5）：1036-1042.

[收稿日期]2019-02-02

本文引用格式：薛梅，張德利，刁慶春，等.丹參酚酸B對過氧化氫引起的黑素細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（6）：64-66.