孫進華 曹璐璐 李煥苓 王果 王樹軍 李芳 王家保 張蕾

摘? 要? 霜疫霉病嚴重危害荔枝果實的產(chǎn)量和質(zhì)量，其病原菌是霜疫霉（Phytophthora litchii Chen ex Ko et al.）。以4×104 cfu/mL霜疫霉孢子懸浮液分別接種抗病品種‘黑葉和感病品種‘桂味的果實，通過掃描電子顯微鏡觀察接種0、1、6、12、24、48、72、96 h后荔枝外果皮顯微結(jié)構(gòu)的變化。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，‘黑葉果皮的龜裂片平整，主要組成單元為微小乳突狀結(jié)構(gòu)，其中間微微凸起且結(jié)構(gòu)致密緊實;‘桂味果皮的裂片谷較深，主要組成單元為微小蜂窩狀結(jié)構(gòu)，其中間凹陷且壁薄挺立。隨著貯藏時間的延長，2個品種外果皮均出現(xiàn)不同程度的損傷，但‘黑葉比‘桂味損傷較輕。用相同濃度霜疫霉孢子接種后，‘桂味果皮附著孢子的數(shù)量是‘黑葉的近5倍，說明‘桂味果皮顯微結(jié)構(gòu)更易于霜疫霉孢子的附著和侵染。接種霜疫霉后，病原菌侵染加劇荔枝外果皮結(jié)構(gòu)的崩解，但‘黑葉外果皮崩解速度較慢。在‘黑葉上霜疫霉的孢子萌發(fā)、菌絲生長和孢子囊形成都晚于‘桂味，說明其對霜疫霉的生長有一定的抑制作用?！谌~和‘桂味果皮顯微結(jié)構(gòu)的差異是其對霜疫霉表現(xiàn)不同抗性的重要原因。

關(guān)鍵詞? 荔枝;霜疫霉;外果皮結(jié)構(gòu);掃描電子顯微鏡

中圖分類號? S436.67+1? ? ? 文獻標識碼? A

Abstract? Litchi downy blight is a damaging oomycete disease， caused by Phytophthora litchii. The 4×104 cfu/mL sporangium suspension was used to inoculate the fruit of the resistant cultivar ‘Heiye and susceptible cultivar ‘Guiwei. The ultra-structural changes of exocarps was investigated by the Scanning Electron Microscopy （SEM） method at 0， 1， 6， 12， 24， 48， 72， and 96 h post-inoculation. The results indicated that the lobe of exocarp was flat and consisted of convex and compact honeycomb in ‘Heiye， while the valley of lobe was deep， and the honeycomb was thin and erect in ‘Guiwei. The integrity of exocarps was damaged with the prolonging of the harvest time. The infection of P. litchii promoted the dissociation of exocarps， as well as the damage degree of ‘Hieye” was lower than that of ‘Guiwei. Under the same inoculation condition， the exocarps of ‘Guiwei harbored nearly five times sporangia than that of ‘Heiye. The character of lobe and honeycomb was more easily agglutinated and infected by the spores of P. litchii in ‘Guiwei. The infection of P. litchii accelerated the breakdown of exocarp structure， which had a small impact on ‘Heiye. Comparing with ‘Guiwei， the gemination of spores， as well as growth of mycelium and formation of sporangia， was lagging in ‘Heiye. It is suggested that the growth of P. litchii is repressed in the exocarps of resistant cultivars. The structure difference of the exocarp is the reason why ‘Guiwei is more susceptible to P. litchii than ‘Heiye.

Keywords? litchi; Phytophthora litchii; structure of exocarp; scanning electron microscopy

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.016

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）原產(chǎn)于中國南部和越南北部，是我國熱區(qū)重要的特色水果[1]。荔枝霜疫霉?。↙itchi downy blight）由霜疫霉菌（Phytophthora litchii Chen ex Ko et al.）引起，是荔枝生產(chǎn)上的主要病害之一。該病主要危害荔枝近成熟果實，引發(fā)大量的裂果、落果和爛果，降低果實產(chǎn)量和品質(zhì)[2-8]。目前，荔枝霜疫霉病的防治主要通過施用化學藥劑，如大生、代森錳鋅和甲霜靈等。雖然藥劑防治效果較好，但長期大量施用對生態(tài)、環(huán)境和食品安全都造成了一定程度的影響。利用植物自身的抗病性防治病蟲害，不僅綠色環(huán)保，而且高效安全。抗性機制的研究能為培育抗性品種奠定理論基礎(chǔ)。

果實表皮是抵御病原菌侵染的第一道屏障，在芒果、龍眼、蘋果、鴨梨和油茶等果樹中證實了其結(jié)構(gòu)與抗病性緊密相關(guān)[9-20]。關(guān)于荔枝的果皮結(jié)構(gòu)，已有學者開展了一些研究。荔枝果皮由外、中、內(nèi)三層組成，其外表面有龜裂片。通過觀察比較不同荔枝品種的表皮結(jié)構(gòu)，彭永宏等[21]發(fā)現(xiàn)品種間果皮結(jié)構(gòu)差異明顯。具體表現(xiàn)為：一部分荔枝品種的龜裂片突起較明顯且排列不整齊，而另一部分品種龜裂片較平整、突起小且排列整齊。潘洵操和胡新宇等[22-23]用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，荔枝外果皮由半球狀突起物組成，其表面分布著不規(guī)則的蜂窩狀坑洼。朱若馨[24]觀察到荔枝果皮的表面由很多低谷和嵴峰構(gòu)成，果皮表面分散著微小裂口。不同荔枝品種的果皮顯微結(jié)構(gòu)存在差異，且與其果實抗病性有一定的關(guān)系。通過霜疫霉孢子接種‘陳紫果實，蔡學清等[25]利用掃描電鏡初步研究了霜疫霉侵染荔枝果皮的過程。

雖然荔枝果皮結(jié)構(gòu)已有一些研究進展，但果皮顯微結(jié)構(gòu)與其對霜疫霉病抗性之間的關(guān)系尚未見報道。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同荔枝品種果實對霜疫霉病表現(xiàn)不同的抗性。其中，‘黑葉在多個年份對霜疫霉病表現(xiàn)穩(wěn)定抗病性，而‘桂味則表現(xiàn)穩(wěn)定感病性[26]。本研究在此基礎(chǔ)上，利用體式顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察比較‘黑葉與‘桂味果皮顯微結(jié)構(gòu)差異，分析接種霜疫霉對其果皮顯微結(jié)構(gòu)的影響，以期闡明荔枝果皮顯微結(jié)構(gòu)與其對霜疫霉抗性之間的關(guān)系。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 荔枝材料? 采摘‘黑葉（抗病品種）和‘桂味（感病品種）約八成熟果實[26]，4 h內(nèi)運回實驗室。挑選成熟度相對一致、大小均一、無病蟲害和機械損傷的果實。先用自來水沖洗干凈，再用無菌去離子水沖洗2遍，自然晾干（約10 min左右）后立即用于接種處理。

1.1.2? 霜疫霉菌株? 菌株為本實驗室從荔枝品種‘三月紅病果上分離，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定其為霜疫霉后純化并保存。接種前活化菌株，然后在28 ℃，10% V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～9 d，收集孢子囊用于荔枝果實接種處理。

1.2? 方法

1.2.1? 孢子囊懸浮液配制? 參照曹璐璐等[26]的方法，在霜疫霉培養(yǎng)皿中加入10 mL無菌水，浸泡菌絲10 min后用雙層無菌紗布過濾收集孢子。顯微鏡觀察計算孢子囊數(shù)量，并調(diào)整孢子囊濃度為4×104 cfu/mL。

1.2.2? 果實接種? 參照曹璐璐等[26]的方法，將自然晾干的果實置于4×104 cfu/mL孢子囊懸浮液中浸泡5 min，取出后稍稍瀝干水分，放置在底部鋪有雙層吸水紙的保鮮盒中（預先用無菌水潤濕以保持濕度）。浸泡5 min無菌水的荔枝果實作為對照組。果實單層擺放，相互之間無擠靠。蓋緊保鮮盒，28 ℃恒溫放置。20個果實作為一次重復，每個處理重復3次。

1.2.3? 掃描電鏡樣品制備和觀察? 果實接種霜疫霉0、1、6、12、24、48、72、96 h后，首先用鑷子撕取果實縫合線兩側(cè)部位的果皮，然后病斑部位用雙面刀片切取成3 mm×3 mm大小的方塊（對照組做同樣處理）。參照李和平[27]的方法制備掃描電鏡樣本并稍有改動，其改動處為分別用丙酮∶醋酸異戊酯按照3∶1、1∶1、1∶3與純醋酸異戊酯進行置換，其他步驟相同。樣品制備后通過掃描電子顯微鏡（ZEISS EVO18）觀察果皮顯微結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.4? 外果皮結(jié)構(gòu)參數(shù)測量? 荔枝果皮結(jié)構(gòu)參數(shù)如下：

裂片峰高度（Peak hight， H1）：裂片峰到內(nèi)果皮的距離（圖1A，圖1F）。

裂片谷厚度（Valley hight， H2）：裂片谷中央到內(nèi)果皮的距離（圖1A，圖1F）。

龜裂片半徑（Protuberance radius， R）：從裂片峰到裂片谷邊緣的距離（圖1B，圖1G）。

裂片谷寬度（Valley width， W）：相鄰龜裂片間的距離（圖1B，圖1G）。

果皮厚度（Pericarp thickness， T）：鄰接裂片峰高度和裂片谷厚度的平均值（T=H1/2+H2/2）。

孢子附著密度（Density of sporangia， D）：接種霜疫霉1 h后每平方厘米果皮附著的孢子囊、次生孢子囊和孢子的總和。

其中，H1和H2值為在體視顯微鏡（ZEISS V12）下測量的數(shù)值，R和W值在掃描電鏡下測量。每個值測量25個樣本，最終計算平均值。D值為掃描電鏡下觀察記錄每個視野的孢子數(shù)，共記錄200個視野，換算成單位面積附著孢子數(shù)并取整。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[28]進行統(tǒng)計分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? ‘黑葉和‘桂味果皮的顯微結(jié)構(gòu)觀察

荔枝果皮由外、中、內(nèi)3層組成。‘黑葉和‘桂味的外果皮為柵狀組織，含有豐富的花色素苷，因而較中果皮和內(nèi)果皮的顏色更深（圖1A，圖1F）。外果皮由龜裂片和連接緊鄰龜裂片的裂片谷組成（圖1B，圖1G）。兩個品種的裂片谷都較為平滑（圖1C，圖1H）。龜裂片可分為三個部分：裂片峰、從裂片峰向下發(fā)散的條狀脊背和除這兩者之外的其他區(qū)域（圖1B，圖1G）。‘黑葉的龜裂片比較平滑，裂片峰微尖（圖1A，圖1B）;‘桂味的龜裂片隆起明顯，裂片峰呈楔形（圖1F，圖1G）。兩個品種龜裂片的脊背都由微小的突起結(jié)構(gòu)組成，排列整齊（圖1D，圖1I）。與‘桂味相比，‘黑葉脊背的突起面積較小，而且凸起不明顯（圖1B，圖1G）。其它區(qū)域是龜裂片的主體部分，占龜裂片面積的90%以上，也由類似的微小單元結(jié)構(gòu)組成。‘黑葉的其他區(qū)域由類似脊背的乳狀突起組成，其結(jié)構(gòu)比較致密，中間凸起，突起間排列緊實（圖1E）。‘桂味的其他區(qū)域由微小的蜂窩狀結(jié)構(gòu)組成，其排列比較稀疏，中間凹陷，連接每個凹陷的壁比較薄且挺立（圖1J）。

‘黑葉和‘桂味的龜裂片半徑（R）分別為2085.6、1440.5 μm（表1），兩者的比值為1.45?！谌~的裂片峰高度（H1）為576.8 μm，不及‘桂味裂片峰高度的三分之二（表1）。綜合考慮龜裂片半徑和裂片峰高度，相同投影面積‘桂味果皮比‘黑葉具有更大的實際面積?！谌~ 的裂片谷寬度（W）也顯著小于‘桂味，而兩者的果皮厚度差異不顯著（表1）?！鹞睹科椒嚼迕祝ㄍ队懊娣e）的果皮附著5077個孢子，幾乎是‘黑葉的5倍（表1）。接種霜疫霉后，孢子和孢子囊大部分吸附在裂片谷、乳突結(jié)構(gòu)（黑葉）連接處或蜂窩狀結(jié)構(gòu)（桂味）的凹陷里（圖2C1～圖2C3，圖2D1～圖2D4）?！鹞断啾取谌~果皮的裂片谷深且寬，更易與孢子和孢子囊的吸附。另外，‘桂味外果皮的蜂窩狀結(jié)構(gòu)非常適合孢子和孢子囊的附著（圖2D3）。

2.2? 采后‘黑葉和‘桂味外果皮結(jié)構(gòu)的變化

在0～48 h時，‘黑葉對照果實的外果皮未觀察到損傷，其結(jié)構(gòu)完整（圖2A1～圖2A6）;在72 h時，觀察到龜裂片的部分突起開始塌陷，果皮開始出現(xiàn)損傷（圖2A7）;在96 h時，龜裂片的突起塌陷加重（圖2A8）。在0～12 h時?！鹞秾φ展麑嵉姆涓C狀結(jié)構(gòu)褶皺明顯而且完整，未發(fā)現(xiàn)損傷（圖2B1～圖2B4）;在24 h時，蜂窩狀結(jié)構(gòu)的褶皺變得模糊，開始趨于平滑（圖2B5）;在48 h時，觀察到龜裂片部分凸起的壁出現(xiàn)缺口，開始出現(xiàn)損傷（圖2B6）;在72 h時，部分蜂窩狀結(jié)構(gòu)被破壞（圖2B7）;在96 h時，蜂窩狀結(jié)構(gòu)破壞更加嚴重，凸起的薄壁崩解成碎片（圖2B8）。

2.3? 霜疫霉侵染荔枝果實及其對外果皮結(jié)構(gòu)的影響

‘黑葉接種霜疫霉后，在0～12 h時，觀察到其外果皮上附著有孢子和孢子囊（圖2C1～圖2C4）;在24 h時，附著的孢子囊延伸出菌絲，且貼著表面生長（圖2C5）;在48 h時，菌絲從乳突結(jié)構(gòu)的間隙侵入中果皮（圖2C6）;在72 h時，侵入中果皮內(nèi)的菌絲開始向四周發(fā)散延伸（圖2C7）;在96 h時，侵染成功的菌絲體形成二指叉狀孢囊梗和成熟的孢子囊（圖2C8）?！鹞督臃N霜疫霉后，在0～6 h時，觀察到孢子附著在龜裂片的蜂窩狀結(jié)構(gòu)中，且6 h時孢子開始萌發(fā)（圖2D1～圖2D3）;在12 h時，在裂片谷中發(fā)現(xiàn)貼壁延伸的菌絲（圖2D4）;在24 h時，侵入到中果皮內(nèi)的菌絲開始呈發(fā)散狀延伸（圖2D6）;在48 h時，有大量的菌絲體緊貼外果皮表面向四周發(fā)散狀延伸（圖2D6）;在72 h時，成熟的菌絲體交織在外果皮表面，并觀察到少量散落的成熟孢子囊（圖2D7）;在96 h時，菌絲體布滿果實表面，形成大量散落的成熟孢子囊（圖2D8）。

霜疫霉的孢子囊呈檸檬形，與其侵染荔枝外表皮后形成的成熟孢子囊相同（圖2C2，圖2C5，圖2C8，圖2D7～圖2D8）。孢子囊生長形成的營養(yǎng)體為無隔菌絲，孢囊梗呈多級有限生長（圖2C5，圖2C7，圖2C8，圖2D5～圖2D8），與前人的研究結(jié)果相同[8， 22-24]。霜疫霉孢子囊接種‘黑葉和‘桂味果實后有2種侵染方式：（1）孢子囊首先釋放游動孢子，然后游動孢子依靠鞭毛移動到合適的位點并吸附到果皮的表面，接著萌發(fā)并從外果皮的嵴點裂縫處侵入，隨后在侵入點生長出菌絲，菌絲擴張并形成孢子囊，進而進行第二輪的侵染（圖2C4，圖2C6）;（2）附著在外果皮的孢子囊直接萌發(fā)出菌絲，菌絲緊貼外果皮表面進行延伸，破壞果皮結(jié)構(gòu)（圖2C5）。這兩種侵染方式可以通過菌絲生長方式進行區(qū)分，前一種的菌絲呈發(fā)散狀向外延伸（圖2C5，C7，圖2D5～6），而后一種是貼著外果皮表面進行生長（圖2C6，圖2D4，圖2D7）。

在0～1 h時，‘黑葉接種霜疫霉和對照的外果皮結(jié)構(gòu)一樣完整，龜裂片的乳突結(jié)構(gòu)凸起明顯（圖2A1，圖2C1）;在6 h 時，龜裂片的乳突結(jié)構(gòu)的凸起部分出現(xiàn)損傷（圖2C3），而對照果皮的乳突結(jié)構(gòu)直到72 h才觀察到損傷（圖2A7）;其后隨著霜疫霉侵染時間的延長，‘黑葉果皮的損傷越來越嚴重（圖2C4～圖2C6，圖2C7～圖2C8）。在0～1 h時，‘桂味接種霜疫霉與對照相比，外果皮結(jié)構(gòu)沒有明顯的區(qū)別; 在6 h時，外果皮的蜂窩狀結(jié)構(gòu)的凸起部分有損傷開始塌陷（圖2D3），較對照出現(xiàn)相似的損傷提前42個小時（圖2D3）;其后隨侵染時間的延長果皮損傷越發(fā)嚴重，直至96 h時完全崩解。霜疫霉的侵染同時加劇了抗、感病品種果皮顯微結(jié)構(gòu)完整性的崩解，但抗性品種的崩解速度相對較慢。

3? 討論

荔枝果皮龜裂片和裂片峰形態(tài)（突起或者平滑）是較為穩(wěn)定的遺傳性狀，是品種分類的一個主要依據(jù)?！谌~的龜裂片平整，裂片峰微尖;而桂味的龜裂片隆起非常明顯，裂片峰尖銳。二者間龜裂片微觀上的差異反映在觸感上‘桂味較為刺手?？?、感病品種間，龜裂片半徑和裂片峰高度都存在顯著差異。感病品種‘桂味不僅具有較小的龜裂片半徑，而且裂片峰較高，導致其相同投影面積果皮比‘黑葉具有更大的表面積。接種相同濃度的霜疫霉，‘桂味較‘黑葉能吸附更多的孢子和孢子囊。數(shù)據(jù)顯示，‘桂味果皮吸附的孢子數(shù)量近‘黑葉的5倍。與‘黑葉相比，‘桂味果皮能吸附較多的霜疫霉孢子，這是‘桂味對霜疫霉病表現(xiàn)感病的原因之一。

‘黑葉果皮的龜裂片主要由微小的乳突狀結(jié)構(gòu)單元組成，其排列緊致。‘桂味的龜裂片主要由微小的蜂窩狀結(jié)構(gòu)單元組成，連接各個蜂窩孔之間的壁薄且挺立。潘洵操和胡新宇等[22-23]發(fā)現(xiàn)荔枝外果皮由許多半球形突起物構(gòu)成，突起物表面有條狀角質(zhì)層或蠟被，表面有許多不規(guī)則的坑洼呈蜂窩狀。彭永宏等[21]觀察表明，龜裂片較平整的品種，如‘黑葉和‘糯米糍，其小突起排列較整齊;龜裂片突起較明顯的品種，如‘桂味和‘禾蝦串，其小突起排列不整齊。這些研究都與本實驗結(jié)果一致。需要注意的是，抗、感病品種間果皮龜裂片組成單元結(jié)構(gòu)迥異?！谌~的組成單元為乳突狀結(jié)構(gòu)，其中間向外凸起;而‘桂味的組成單元為蜂窩狀結(jié)構(gòu)，其中間向內(nèi)凹陷。組成單元的結(jié)構(gòu)差異對荔枝的抗病性有直接的影響。

霜疫霉孢子在‘黑葉中主要吸附在乳突狀結(jié)構(gòu)凸起的連接處，孢子數(shù)量較少;而‘桂味中主要吸附在蜂窩狀結(jié)構(gòu)的凹陷中，孢子數(shù)量較多。蜂窩狀結(jié)構(gòu)較乳突狀結(jié)構(gòu)更利于孢子的吸附。不僅如此，24 h時‘桂味果皮的顯微結(jié)構(gòu)開始崩解，而‘黑葉中直到72 h才觀察到損傷，說明乳突狀結(jié)構(gòu)比蜂窩狀結(jié)構(gòu)有更強的抵御損傷的能力。接種霜疫霉6 h后，在兩個品種的果皮結(jié)構(gòu)都觀察到損傷，霜疫霉侵染破壞了荔枝外果皮顯微結(jié)構(gòu)的完整性，加劇了果皮的損傷程度?！谌~乳突狀結(jié)構(gòu)的排列較為緊密，連接處的凹陷較淺，病原菌侵染穿透果皮的難度較大?！鹞斗涓C狀結(jié)構(gòu)的壁較薄，中間的凹陷較深，病原菌能很容易的穿透果皮。乳突狀結(jié)構(gòu)和蜂窩狀結(jié)構(gòu)的差異是抗、感病品種抗性差異的另一個重要原因。

霜疫霉侵染荔枝果實有兩種方式：一是釋放游動孢子從果皮裂縫侵入內(nèi)果皮，菌絲發(fā)散生長并形成孢子囊;二是孢子囊直接萌發(fā)形成菌絲，菌絲緊貼外果皮表面生長。蔡學清等[25]發(fā)現(xiàn)，霜疫孢子囊聚集在接種果皮的嵴點裂縫處，一部分萌發(fā)成芽管直接從果皮嵴點裂縫處和皮孔侵入，另一部分釋放游動孢子，游動孢子再萌發(fā)形成芽管從果皮的嵴點裂縫處侵入。兩種侵染方式本研究中都觀察到，由于技術(shù)原因未能判斷哪種方式為主要的侵染形式，留待下一步的研究。接種霜疫霉6 h后，‘桂味果皮表面觀察到孢子的萌發(fā)，而在‘黑葉中未見，‘黑葉中霜疫霉孢子的萌發(fā)時間較晚。接種24 h時，兩個品種的果皮表面都已長出菌絲;48 h時，菌絲體已侵入內(nèi)果皮，隨后菌絲體大量生長。霜疫霉在‘黑葉果皮形成孢子需要96 h，生成的孢子囊較少;在‘桂味果皮上僅72 h就能形成的孢子囊，時間較短。兩品種間霜疫霉侵染過程存在一定的差異，主要為在‘黑葉果皮表面霜疫霉的孢子萌發(fā)、菌絲生長和孢子囊的形成要滯后于‘桂味?？共∑贩N‘黑葉對霜疫霉生長的抑制是其表現(xiàn)抗性的原因之一。

4? 結(jié)論

通過顯微觀察荔枝抗、感病品種果皮結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)抗性品種‘黑葉果實具有較小的比表面積，外果皮組成單元主要為乳突狀結(jié)構(gòu)，其排列緊致;而感病品種‘桂味果實具有較大的比表面積，外果皮組成單元主要為蜂窩狀結(jié)構(gòu)，其排列稀疏。隨著時間的延長，荔枝采后果皮結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)一定程度的損傷，而霜疫霉菌的侵染加劇了這一過程。荔枝外果皮的微觀結(jié)構(gòu)與其對霜疫霉病的抗性緊密相關(guān)。一方面，‘黑葉較小的比面積導致較少的霜疫霉孢子吸附;另一方面，‘桂味稀疏排列的蜂窩狀結(jié)構(gòu)利于霜疫霉孢子從縫隙處侵染果實。加之抗性品種‘黑葉對霜疫霉的孢子萌發(fā)、菌絲生長和孢子形成具有抑制作用，導致‘黑葉和‘桂味對霜疫霉菌的侵染表現(xiàn)不同的抗性。荔枝外果皮結(jié)構(gòu)特征可作為鑒定果實對霜疫霉病抗性的重要依據(jù)，在荔枝抗病育種中加以應(yīng)用。

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