兩親性殼聚糖/槲皮素納米膠束的制備及其理化性質(zhì)研究

王慧 楊子明 何祖宇 周闖 王超 李普旺

摘? 要? 槲皮素（QCT）是一種類黃酮化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎等作用，在熱帶植物界中廣泛存在。但由于槲皮素溶解度低、穩(wěn)定性差，因此限制了其在食品、醫(yī)藥中的應(yīng)用。本研究以脫氧膽酸（DA）為疏水基團(tuán)，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）作為親水基團(tuán)合成了一種新型兩親性殼聚糖（ACS），并制備了兩親性殼聚糖槲皮素納米膠束（ACS-QNMs）。結(jié)果表明，傅里葉紅外光譜分析證明DA和NAC已成功接枝到殼聚糖上，熒光分光光度計(jì)測定空白膠束的臨界膠束濃度值（CMC）為26.92 μg/mL，掃描電鏡觀察納米載藥膠束外觀呈球形且分布均勻。納米粒度電位分析儀測定納米膠束電位為31 mV。研究表明，槲皮素經(jīng)兩性殼聚糖包埋后，能在人體溫度37 ℃下緩慢釋放，同時(shí)在室溫下穩(wěn)定儲(chǔ)存。

關(guān)鍵詞? 兩親性殼聚糖;槲皮素;納米膠束;熒光分光光度計(jì)

中圖分類號(hào)? R318.08? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? Quercetin （QCT） is a flavonoid compound with strong antioxidant and anti-inflammatory effects， which is widely found in tropical plants. However， the low solubility and poor stability of quercetin limit its application in food and medicine. In this study， a novel amphiphilic chitosan （ACS） with deoxycholic acid （DA） as the hydrophobic group and n-acetyl-l-cysteine （NAC） as the hydrophilic group was synthesized， and the amphiphilic chitosan quercetin nanoparticle micelle （ACS-QNMs） was prepared and characterized. FTIR showed that DA and NAC were grafted onto chitosan successfully. The critical micelle concentration （CMC） of blank micelles was 26.92 μg/mL. Scanning electron microscopy （SEM） was used to observe the spherical appearance and uniform distribution of nanoparticles. The micelle potential was determined by nano particle size potentiometer to be 31 mV. The results showed that quercetin could be released in vivo and stored stably at room temperature after being embedded in nanomicelles.

Keywords? amphiphilic chitosan; quercetin; nanomicelles; fluorescence spectrophotometer

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.021

槲皮素是一種多羥基類黃酮化合物，在亞熱帶植物體內(nèi)廣泛存在，具有抗氧化、降血壓、降血脂、抗炎等多種生物學(xué)活性[1]。但由于槲皮素為平面型分子，分子間引力較大，且不容易被溶劑或溶質(zhì)分散，因此其水溶解度低，化學(xué)穩(wěn)定性差，很大程度上限制了槲皮素作為功能成分在食品和醫(yī)藥中的應(yīng)用[2]。納米微膠囊化技術(shù)具有藥物保護(hù)作用，能避免芯材受到外界不良環(huán)境的影響，并具有靶向遞送和控制釋放等特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注[3-4]。采用納米微膠囊技術(shù)提高類似槲皮素的植物源天然產(chǎn)物的生物利用率以提升其經(jīng)濟(jì)價(jià)值是目前一大研究熱點(diǎn)。Aluani等[5]以殼聚糖/海藻酸鈉為壁材包埋槲皮素，并對其進(jìn)行安全性以及性能評(píng)價(jià)，研究表明，經(jīng)包埋后槲皮素抗氧化活性增強(qiáng)，槲皮素納米粒子在體外無顯著細(xì)胞毒性，口服空載納米粒子以及槲皮素納米粒子都不會(huì)引起大鼠肝臟生化參數(shù)的變化。Wang等[6]通過薄膜水合和真空冷凍干燥技術(shù)將槲皮素包封在聚合物膠束中，提高槲皮素的水溶性和穩(wěn)定性，結(jié)果表明，凍干納米膠束粒徑范圍20～80 nm，在Caco-2細(xì)胞上展示出低細(xì)胞毒性，但對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒性;體內(nèi)試驗(yàn)表明，槲皮素納米膠束有益于攜帶神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠的存活。因此，納米微膠囊化技術(shù)能增強(qiáng)藥物溶解行并持續(xù)釋放，是一種極具應(yīng)用前景的遞送方法。

殼聚糖是自然界中唯一堿性多糖，生物相容性好，對生物體無毒且可降解[7-8]。由于其是剛性直鏈分子，溶解度低，可通過引入一些官能團(tuán)對其進(jìn)行修飾，制備功能性的兩親性殼聚糖是目前一大研究熱點(diǎn)[9]。具有疏水鏈與親水鏈的兩親性殼聚糖作為疏水藥物載體，在水中的自組裝形成膠束也引起了廣泛的關(guān)注[10-11]。殼聚糖的疏水端與藥物接觸形成疏水內(nèi)核，親水鏈與外部水相接觸形成穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)。兩親性殼聚糖作為壁材能有效的提高藥物的溶解度和生物利用率，并降低毒副作用。Sukamporn等[12]通過兩親性殼聚糖形成自組裝膠束，其臨界膠束值為37.2 μg/mL。載有虎刺醛的納米膠束呈球形，且平均粒徑約200 nm。細(xì)胞毒性研究表明該遞送體系具有較高遞送效率且安全可靠，可作為如虎刺醛等疏水性化合物的載體。

本研究通過將脫氧膽酸和N-乙酰-L-半胱氨酸分別接枝到殼聚糖氨基上合成兩親性殼聚糖，并通過傅里葉紅外光譜對其進(jìn)行表征。通過超聲自組裝法包封槲皮素制備槲皮素納米膠束，并對納米膠束進(jìn)行物理與化學(xué)表征。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 殼聚糖（CS，黏度<200 mPa?s，脫乙酰度97.8%）以及N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）都采購于中國Aladdin公司。槲皮素（QUE，含量≥95%）采購于美國Sigma試劑公司。脫氧膽酸（DA）采購于日本化成工業(yè)株式會(huì)社。1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDAC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），1-羥基-苯并三唑（Hobt）和5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）都采購于中國Aladdin公司。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? UV1700型紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司;FTS3000型傅里葉紅外光譜儀，美國伯樂公司;F7000型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司;Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，杭州大力科教儀器有限公司;真空冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司。

1.2? 方法

1.2.1? 脫氧膽酸接枝殼聚糖的合成? 按文獻(xiàn)[13-15]中的方法并加以改進(jìn)，采用乙二胺為催化劑使脫氧膽酸與殼聚糖胺基反應(yīng)，生成脫氧膽酸改性殼聚糖（CS-DA）。將1 g殼聚糖溶解在40 mL 1%乙酸溶液中，再用40 mL無水乙醇稀釋。將一定量脫氧膽酸溶解在乙醇中再加入乙二胺以活化脫氧膽酸的羧基。反應(yīng)24 h后，逐滴加入終止劑乙醇/氨水溶液（7/3，V/V）。凝膠狀沉淀物用乙醇離心洗滌后冷凍干燥48 h，得到白色粉末狀脫氧膽酸接枝殼聚糖（CS-DA）。

1.2.2? N-乙酰-L-半胱氨酸接枝脫氧膽酸殼聚糖的合成? 以N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）為親水基團(tuán)接枝CS-DA，制備兩親性殼聚糖[16-18]。將1 g CS-DA溶解于50 mL含有0.768 g Hobt水溶液中。另外，4 g NAC和2.908 g EDAC溶解在25 mL水中，并在室溫下攪拌以活化NAC的羧基。將這2個(gè)混合液混合后調(diào)整溶液的pH為5，在45 ℃下避光反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，用一定量無水乙醇洗滌抽濾。將洗滌后的沉淀溶解在水中，裝入透析袋透析3 d。第1天，透析液為1 mmol/L鹽酸和含有1%氯化鈉水溶液，后2 d用含有0.2 mmol/L鹽酸水溶液透析。經(jīng)冷凍干燥得到兩親性殼聚糖固體粉末。

1.2.3? 槲皮素納米膠束的制備? 采用自組裝法制備了兩親殼聚糖納米膠束。將5 mg 兩親性殼聚糖粉末溶解在10 mL去離子水中。在室溫下超聲處理10 分鐘，得到兩親性殼聚糖空白膠束。然后將1 mg的槲皮素固體粉末添加到殼聚糖空白膠束中，混合均勻后在室溫下超聲處理15 min，形成包埋槲皮素的納米膠束。

1.2.4? 傅里葉紅外光譜表征? 將改性后的兩親性殼聚糖研磨成粉末，采用KBr壓片法，F(xiàn)TIR測樣品采集記錄光譜數(shù)據(jù)，根據(jù)特征吸收峰推斷其化學(xué)結(jié)構(gòu)。掃描范圍從4000 cm1到400 cm1，掃描間距為4 cm1[19]。

1.2.5? 熒光分光光度計(jì)分析? 采用熒光分光光度計(jì)法，以芘（1，6-二苯基-1，3，5-六三烯，DPH）作為熒光探針，測定兩親性殼聚糖空白膠束的臨界膠束濃度（CMC）[20]。膠束測定濃度從5×104 ～5×107 mg/mL。在激發(fā)波長為338 nm，發(fā)射波長為360～450 nm的條件下，用F-7000熒光光譜儀對空白納米膠束樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量。選取第1個(gè)峰（373 nm）和第3個(gè)峰（405 nm）處的吸收峰強(qiáng)度比作為縱坐標(biāo)，濃度對數(shù)作為橫坐標(biāo)，作圖得到兩直線，其交點(diǎn)為CMC。

1.2.6? 掃描電子顯微鏡（SEM）分析? 將納米膠束滴加在銅網(wǎng)上自然晾干，通過掃描電鏡在電壓10 kV下觀察槲皮素納米膠束的表面形態(tài)。

1.2.7? 粒度與電位測定? 通過納米粒度-電位分析儀對兩親性殼聚糖空白納米膠束和槲皮素納米膠束的粒度和zeta電位進(jìn)行評(píng)估。樣品濃度為1 mg/mL。測定槲皮素納米膠束的粒度以及電位，每個(gè)指標(biāo)測量3次。

1.2.8? 包封率與載藥率的測定? 將槲皮素納米膠束用離心機(jī)在8000 r/min 處理5 min，上清液為被包封的槲皮素，沉淀物是未包埋的槲皮素。用紫外分光光度計(jì)在370 nm波長下測量上清液的吸光度，用線性回歸方程（Y=0.053 37X+0.0014， R2 = 0.999 57）計(jì)算槲皮素的含量。根據(jù)下式計(jì)算槲皮素包埋率（EE）和載藥率（DL）：

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示。當(dāng)獲得的P值小于0.05時(shí)表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 近紅外光譜分析

殼聚糖和兩親性殼聚糖的紅外光譜譜圖如圖1所示。圖1（a）顯示CS的3個(gè)主要特征峰，1658 cm1 是C = O酰胺Ⅰ伸縮振動(dòng)，1575 cm1是酰胺Ⅱ，N-H 脫乙酰胺彎曲振動(dòng)，3429 cm1是O-H伸縮振動(dòng)吸收峰。圖1 （b） 是兩親性殼聚糖的紅外光譜，2548 cm1為H-S吸收峰，1658 cm1為C=O吸收峰，與殼聚糖相比，增加2個(gè)特征峰。N-乙酰-L-半胱氨酸的特征峰2548 cm1處巰基特征峰的出現(xiàn)，證實(shí)親水基團(tuán)N-乙酰-L-半胱氨酸通過酰氨基鍵化學(xué)合到殼聚糖分子上。此外，1658 cm1處的新吸收峰表明DA的羧基與CS的游離氨基反應(yīng)，形成新的酰胺官能團(tuán)。通過紅外光譜證實(shí)脫氧膽酸和N-乙酰-L-半胱氨酸成功接枝殼聚糖，形成新型兩親性殼聚糖。

2.2? 兩親性殼聚糖納米膠束的自組裝

以芘為熒光探針，研究兩親性殼聚糖在水中的自組裝行為。芘與兩親性殼聚糖納米膠束疏水區(qū)域相接觸，兩親性親水端暴露在水環(huán)境中維持膠束穩(wěn)定[21]。如圖2所示，兩親性殼聚糖的臨界膠束值為26.92 μg/mL。結(jié)果表明，隨著兩親性殼聚糖濃度的增大，芘的發(fā)射光譜強(qiáng)度逐漸增大。由于芘所處介質(zhì)的極性變化，使得芘發(fā)射光譜的振動(dòng)峰強(qiáng)度隨之變化。當(dāng)殼聚糖溶液濃度低于17.78 μg/mL時(shí)，I373/I405值為1.135左右無顯著變化，表明在此濃度范圍內(nèi)，兩親性殼聚糖僅以單鏈的形式分散在水中，非穩(wěn)定膠束形式存在。當(dāng)殼聚糖濃度高于17.78 μg/mL時(shí)，兩親性殼聚糖在水中自組裝形成納米膠束，分子間作用力提高，疏水性的芘由極性極強(qiáng)的水中轉(zhuǎn)移到非極性的納米膠束疏水微區(qū)中，導(dǎo)致發(fā)射光譜發(fā)生變化[22]。

2.3? 槲皮素納米膠束的粒徑和電位分析

采用納米粒度分析儀測得槲皮素納米膠束粒度平均粒徑約370 nm，呈正態(tài)分布，如圖3所示。PDI值為0.234，粒徑大小分布均勻主要集中在140～600 nm。研究表明，槲皮素在兩親性殼聚糖水溶液中完全溶解，且采用超聲自組裝法制備的納米膠束粒徑均勻。采用納米粒度電位分析儀測量兩親性殼聚糖水溶液即空白納米膠束電勢為正，約43.2 mV。將槲皮素固體粉末溶解在空白膠束溶液中，采用超聲自 組裝的方法將槲皮素封裝在帶有正電荷的兩親性殼聚糖溶液中，所得載藥納米膠束電勢減小約31 mV。由此說明，槲皮素納米膠束的形成與靜電作用有關(guān)。槲皮素納米膠束最終電位大于30 mV，表明該體系相對較穩(wěn)定。

2.4? 槲皮素納米膠束掃描電鏡外觀形態(tài)分析

由圖4可以看出，槲皮素納米膠束微觀形態(tài)為球形，分布較為均勻。研究表明，槲皮素納米膠束風(fēng)干后的掃描電鏡尺寸與納米粒度及電位分析儀結(jié)果較為接近。

2.5? 槲皮素納米膠束的載藥率和包封率

由槲皮素線性擬合方程，測得槲皮素的包封率和載藥率隨槲皮素投料量的增加而改變。包封率為79.96%、74.34%、69.56%、64.13%和61.07%，載藥率為11.35%、15.42%、18.23%、22.96%和26.44%。計(jì)算得到平均包封率和載藥率分別為69.81%和18.88%。從圖5中可知，納米載藥膠束的包封率和載藥率隨芯材槲皮素投入量的增加而變化。當(dāng)槲皮素投入量由50 μg增加到500 μg時(shí)，包封率由79.96%降低至61.07%，而載藥率由原11.35%提升至26.44%。投入量由50 μg增加到300 μg時(shí)，載藥率上升速度較快，包封率下降趨勢較快，兩者變化速率有相似規(guī)律。結(jié)果表明，兩親性殼聚糖納米膠束對槲皮素具有較好的包埋能力，有利于槲皮素水溶度以及生物利用度的提高。

2.6? 槲皮素納米膠束體外釋放分析

研究槲皮素納米膠束在生理pH 7.4條件下分別在體溫37 ℃和室溫28 ℃的釋放情況。圖6是槲皮素納米膠束的釋放曲線，在前10 h，出現(xiàn)爆發(fā)式釋放，隨后釋放速度減慢。在37 ℃下釋放72 h時(shí)，累計(jì)釋放率高達(dá)51.96%，在28 ℃下釋放72 h時(shí)，累計(jì)釋放率分別為22.37%。通過比較不同溫度下槲皮素納米微膠囊的釋放情況，得出控制溫度，納米微粒結(jié)構(gòu)在人體溫37 ℃下不穩(wěn)定，有利于槲皮素的釋放。在室溫28 ℃下，槲皮素納米膠束釋放緩慢較穩(wěn)定，有利于其具有生物活性的芯材長期貯存。

3? 討論

通過傅里葉紅外光譜分析確定合成的兩親性殼聚糖，紅外測得在2540 cm1處出現(xiàn)巰基特征峰與Rajawat等[16]和Croce等[23]研究結(jié)果相似。通過接枝脫氧膽酸后形成新的酰胺官能團(tuán)在1624 cm1處出現(xiàn)新吸收峰，此結(jié)果與Sukamporn等[12]的研究結(jié)果相似。以兩親性殼聚糖作為載體，制備槲皮素納米膠束。兩親性殼聚糖納米膠束載體，表現(xiàn)出更高的藥物負(fù)載能力，特別是對于疏水藥物，能有效的提高疏水藥物利用率，增強(qiáng)藥物靶向作用[24-25]。N-乙酰-L-半光氨酸接枝殼聚糖具有較好的生物相容性和生物可降解性，無毒性[26]。此外，殼聚糖改性后黏附性和通透性顯著增強(qiáng)[27]。脫氧膽酸是膽汁酸中的主要成分，常作為疏水基團(tuán)修飾親水聚合物，制備兩親性自組裝載體材料[28]。劉真真等研制的H-ESO-HEC兩親性聚合物臨界膠束濃度測得292～ 336 μg/mL[29]。本研究以改性殼聚糖作為載體，通過芘作為疏水探針采用熒光分光光度計(jì)法研究得到，臨界膠束值顯著降低至26.92 μg/mL。能有效地降低成本，提高殼聚糖等原料的利用率。兩親性殼聚糖可在較低濃度下形成膠束，成本較低，有利于納米膠束的開發(fā)利用。納米膠束PdI值為0.234，證明超聲處理有利于納米粒子粒徑均勻。通過Zeta電位研究表明，槲皮素納米載藥膠束在水性環(huán)境中帶正電約31 mV，證明該體系較為穩(wěn)定[30]。膠束微觀結(jié)構(gòu)為球形，與掃描電鏡相似，表面光滑，比表面大，與普通納米微膠囊結(jié)構(gòu)相比有利于載藥量的提升。利用紫外分光光度計(jì)法，測得槲皮素納米膠束平均載藥率和包封率分別為18.88%和69.81%，研究表明在芯材投入量在50 μg到500 μg的范圍內(nèi)，納米膠束載藥率與芯材投入量正相關(guān)，而包封率與其投入量負(fù)相關(guān)。由于疏水藥物槲皮素與兩性親殼聚糖之間存在較強(qiáng)相互作用力，槲皮素投入量增加，作用力逐漸增大，槲皮素包埋率不斷減小，載藥率不斷提高。在體外釋放研究中，發(fā)現(xiàn)納米膠束緩釋受溫度的影響。在人體體溫37 ℃時(shí)，累計(jì)釋放量顯著高于室溫（28 ℃），納米膠束在熱條件下不穩(wěn)定，有利于槲皮素的釋放，從而達(dá)到在體內(nèi)加快釋放卻在室溫條件下穩(wěn)定貯藏的目的。開發(fā)有效的疏水藥物載體在醫(yī)藥和食品中具有重大意義，能有效地提高疏水物質(zhì)的生物利用率，納米載體的應(yīng)用加快了發(fā)展進(jìn)程[22， 31]。以可降解生物無毒性的殼聚糖為原料制備的槲皮素納米膠束，為槲皮素等疏水物質(zhì)的開發(fā)利用提供新思路。

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