郭 斌 梁萌青 徐后國 衛(wèi)育良 張慶功 李本相 廖章斌

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306)

植物蛋白質(zhì)具有來源廣、產(chǎn)量穩(wěn)定、價格低廉等優(yōu)點，一直作為替代魚粉的蛋白質(zhì)來源，但由于植物蛋白質(zhì)含有抗營養(yǎng)因子(趙曉丹,2015)，并缺乏魚類所需的一些必需氨基酸和促生長成分，并不能完全替 代魚粉。海藻是海洋中的一類自養(yǎng)植物，與陸生植物相比，海藻含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、海藻多糖、不飽和脂肪酸、游離氨基酸以及具有誘食作用的一些物質(zhì)，可以補充陸生植物蛋白質(zhì)大量替代魚粉所造成的營養(yǎng)缺乏(常巧玲等,2006; 李人光等,2009)。

紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)是目前主要的東方鲀養(yǎng)殖種類之一，其魚肉鮮美，營養(yǎng)豐富，具有高蛋白、低脂肪的特點，有極高的經(jīng)濟價值。紅鰭東方鲀對蛋白質(zhì)的需求量較高，有研究表明，紅鰭東方鲀對飼料中蛋白質(zhì)的需求在 40%～50% (Kimet al,2009;王淑敏,2008)。目前紅鰭東方鲀的人工養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)比較成熟，但對紅鰭東方鲀營養(yǎng)需求和配合飼料的研究滯后，研發(fā)高效低成本的專用配合飼料成為東方鲀產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。本研究以常見的 2種低值海藻[江蘺(Gracilaria verrucosa)、滸苔(Enteromorpha prolifera)]和2種工業(yè)下腳料(海帶提取褐藻膠后的藻渣、土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸后的菌渣)與植物蛋白質(zhì)配合成混合植物蛋白質(zhì)替代紅鰭東方鲀幼魚飼料中部分魚粉，探究其對紅鰭東方鲀幼魚生長性能、血清和肝臟生化指標和體組成的影響，以期為海藻及工業(yè)下腳料在紅鰭東方鲀飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗共配制6種等氮、等脂的實驗飼料，以含魚粉60%為對照組1和含45%魚粉為對照組2，分別以10%的江蘺、滸苔、藻渣(海帶提取褐藻膠后的廢渣)、菌渣(土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸后的廢渣)與植物蛋白質(zhì)配合后替代魚粉對照組1中30%的魚粉。所有原料粉碎后過80目篩網(wǎng)，按配方稱量，逐級混勻，然后加魚油混勻，加30%水攪拌均勻，用制粒機制成直徑為2 mm的顆粒飼料，55℃鼓風干燥12 h后置于-20℃冷庫保存。江蘺、滸苔、藻渣和菌渣的常規(guī)營養(yǎng)成分見表1，實驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表2，實驗飼料氨基酸組成見表3。

表1 江蘺、滸苔、藻渣和菌渣的常規(guī)營養(yǎng)成分 (干物質(zhì)基礎(chǔ)，%)Tab.1 Proximate nutritional components of G.verrucosa,E.prolifera,algae residue and fungi residue (DM basis,%)

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖實驗在山東省煙臺市天源水產(chǎn)有限公司進行，實驗所用紅鰭東方鲀幼魚購自山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司。實驗開始前先使用對照組飼料暫養(yǎng)7 d，使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境和飼料的大小、硬度。實驗采用自然光照，養(yǎng)殖模式為流水養(yǎng)殖，水源為自然海水，水溫為14～25℃，溶氧濃度為5.5 mg/L左右，鹽度為35左右，pH為7.5～8.0。

實驗開始前停食24 h，然后隨機選取健康、規(guī)格一致的紅鰭東方鲀幼魚，初始體重為(17.33±0.55) g，隨機分配到18個容積為150L的塑料養(yǎng)殖桶中，每個桶中投放25尾。將18個養(yǎng)殖桶隨機分為6組，每組3個養(yǎng)殖桶，每組隨機投喂1種實驗飼料。養(yǎng)殖實驗期間每天早、中、晚各表觀飽食投喂1次，投喂0.5 h后對每個桶內(nèi)的殘餌計數(shù)，根據(jù)每100粒飼料的平均質(zhì)量，計算殘餌質(zhì)量。養(yǎng)殖28 d后養(yǎng)殖桶換為500 L大桶，換桶沒有造成魚死亡。實驗時間為 2017年8月～2017年10月，養(yǎng)殖周期共56 d。

1.3 樣品采集與分析

實驗開始前隨機取20尾紅鰭東方鲀幼魚作為初始魚，用于常規(guī)營養(yǎng)成分分析。實驗結(jié)束后，饑餓24 h，對每桶魚進行計數(shù)、稱重。每桶隨機取3尾魚，尾靜脈取血，用 1%肝素鈉抗凝，4℃靜置 4 h后3500 r/min離心10 min，取上層血清，置于液氮中保存；采血后的魚稱重并測量體長，解剖分離內(nèi)臟團和肝臟并稱重，計算肥滿度、肝體比和臟體比，取肝臟置于液氮中保存。每桶另隨機取3尾魚用于體成分分析。

飼料和魚體常規(guī)營養(yǎng)成分分析參考AOAC(1995)的方法。其中，水分含量測定采用105℃烘干至恒重法，粗蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法(VELP凱氏定氮儀，UDK-142 Automatic Distillation Unit，意大利)，粗脂肪含量測定采用索氏抽提法，以石油醚作為抽提液(SOXTEC2050 FOSS脂肪測定儀，瑞典)，粗灰分含量采用馬弗爐(550℃)灼燒6 h測得。

肝臟中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、溶菌酶(LZM)活性以及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、ACP、AKP、GOT、GPT、LZM 活性和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定。

飼料中氨基酸組成的測定參考GB/T 18246-2000的方法，使用L-8900全自動氨基酸分析儀(Hitachi，日本)測定。檢測了飼料中9種必需氨基酸、8種非必需氨基酸和?；撬岬暮?，色氨酸因酸水解破壞而未檢測。

表2 實驗飼料配方及營養(yǎng)組成(干物質(zhì)基礎(chǔ)，%)Tab.2 Formula and nutrient composition of experimental diets (DM basis,%)

1.4 計算公式

成活率(Survival rate，SR，%)=100×終末魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)；

攝食率(Feed intake，F(xiàn)I，%/d)=100×攝食飼料干重/[實驗天數(shù)×(初始體重+終末體重)/2]；

特定生長率(Special growth rate，SGR，%/d)= 100×(ln終末體重-ln初始體重)/實驗天數(shù)；

飼料效率(Feed efficiency ratio，F(xiàn)ER)=(終末體重- 初始體重)/攝食飼料干重；

蛋白質(zhì)沉積率(Protein productive value,PPV,%)=100×魚體蛋白質(zhì)沉積量/總飼料蛋白質(zhì)攝入量；

蛋白質(zhì)效率(Protein efficiency ratio,PER)=(終末體重-初始體重)/總飼料蛋白質(zhì)攝入量；

肝體比(Hepatosomatic index,HIS,%)=100×肝臟重/體重；

臟體比(Viscerosomatic index,VSI,%)=100×內(nèi)臟團重/體重；

肥滿度(Condition factor,CF)=100×體重/體長3(體重單位：g；體長單位：cm)。

表3 實驗飼料氨基酸組成(干物質(zhì)基礎(chǔ)，%)Tab.3 Amino acid composition of experimental diets (DM basis,%)

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進行處理，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)程序進行方差分析，若存在顯著差異(P＜0.05)，則采用 Duncan氏法進行組間的多重比較。結(jié)果以平均值±標準誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚生長性能的影響

江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚生長性能的影響如表4所示。各組紅鰭東方鲀幼魚的存活率介于80%～90%，藻渣組顯著高于對照組2 (P＜0.05)，與對照組 1、江蘺、滸苔和菌渣組無顯著差異(P＞0.05)；滸苔組 SGR最高，顯著高于含 60% 魚粉的對照組 1、45%魚粉的對照組 2、江蘺、藻渣和菌渣組(P＜0.05)，藻渣組顯著高于對照組2和江蘺組(P＜0.05)，與對照組 1組和菌渣組無顯著差異(P＞0.05)；對照組2和菌渣組飼料攝食率顯著高于對照組1和江蘺組(P＜0.05)，與滸苔和藻渣組無顯著差異(P＞0.05)；對照組 1、滸苔組飼料效率顯著高于對照組2和菌渣(P＜0.05)，與江蘺和藻渣組無顯著差異(P＞0.05)；對照組1的蛋白質(zhì)沉積率和蛋白質(zhì)效率顯著高于對照組2和菌渣組(P＜0.05)，與江蘺、滸苔和藻渣組無顯著差異(P＞0.05)。

藻渣組肝體比顯著高于對照組1、對照組2、江蘺和菌渣組(P＜0.05)，與滸苔組無顯著差異(P＞0.05)；藻渣組臟體比顯著高于對照組 2(P＜0.05)，與對照組1、江蘺、滸苔和菌渣組無顯著差異(P＞0.05)；各組的肥滿度無顯著差異(P＞0.05)。

表4 江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚生長性能和形體指標的影響 Tab.4 Effects of fish meal replacement by G.verrucosa,E.prolifera,algae residueand fungi residue on the growth performance and physical parameters of juvenile tiger puffer

2.2 江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚血清和肝臟生化指標的影響

江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀血清和肝臟中GPT和GOT活性的影響如表5所示。各組血清和肝臟中 GPT和 GOT活性均無顯著差異(P＞0.05)。

江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚血清和肝臟非特異性免疫和抗氧化指標的影響如表6所示。對照組1血清ACP活性顯著高于對照 組2和滸苔組(P＜0.05)，與江蘺、藻渣和菌渣組無顯著差異(P＞0.05)；江蘺和藻渣組血清AKP活性顯著高于對照組 1、對照組 2和菌渣組(P＜0.05)，與滸苔組無顯著差異(P＞0.05)；滸苔組血清溶菌酶活性顯著高于江蘺組(P＜0.05)，與對照組1、對照組2、藻渣和菌渣組無顯著差異(P＞0.05)；各組血清中 MDA含量和SOD活性均無顯著差異(P＞0.05)。

各組肝臟ACP活性無顯著差異(P＞0.05)；對照組2和菌渣組肝臟 AKP活性顯著高于對照組 1 (P＜0.05)，與江蘺、滸苔和藻渣組無顯著差異(P＞0.05)；對照組2和江蘺組肝臟溶菌酶活性顯著高于對照組1、藻渣和菌渣組(P＜0.05)，與滸苔組無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚體組成的影響

江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚體組成的影響如表7所示。各組魚體的水分含量均無顯著差異(P＞0.05)；菌渣組魚體粗蛋白質(zhì)含量顯著高于藻渣組(P＜0.05)，與對照組1、對照組2、江蘺和滸苔無顯著差異(P＞0.05)；滸苔和藻渣組魚體粗脂肪含量顯著高于對照組2(P＜0.05)，與對照組1、江蘺和菌渣組無顯著差異(P＞0.05)；滸苔和菌渣組魚體灰分含量顯著低于江蘺組(P＜0.05)，顯著高于藻渣組(P＜0.05)，與對照組 1和對照組 2無顯著差異(P＞0.05)。

表5 江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚血清和肝臟中GPT和GOT活性的影響Tab.5 Effects of fish meal replacement by G.verrucosa,E.prolifera,algae residue and fungi residue on GPT and GOT activities in serum and liver of juvenile tiger puffer

表6 江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚血清和肝臟非特異性免疫和抗氧化指標的影響Tab.6 Effects of fish meal replacement by G.verrucosa,E.prolifera,algae residue and fungi residue on the serum and liver non-specific immune and antioxidant indices of juvenile tiger puffer

表7 江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚體組成的影響(濕重基礎(chǔ)，%)Tab.7 Effects of fish meal replacement by G.verrucosa,E.prolifera,algae residue and fungi residue on the body composition of juvenile tiger puffer (Wet weight basis,%)

3 討論

在以往的植物蛋白替代魚粉的研究中，肉食性魚類飼料中植物蛋白替代魚粉的比例較低。大菱鲆(Scophthalmus maxima)飼料中植物蛋白可以替代17%～21%的魚粉而不影響其生長性能和飼料效率(Dayet al,2000; 陳超等,2012)；豆粕可以替代飼料中16%的魚粉而不影響花鱸(Lateolabrax japonicus)生長(王國霞等，2014)；菜籽粕可以替代飼料中 13.5%的魚粉而不影響虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的生長性能和飼料利用(崔存河等,2016)。在對紅鰭東方鲀的研究中發(fā)現(xiàn)，豆粕可以替代飼料中13%左右的魚粉而不影響紅鰭東方鲀生長(Kikuchiet al,2009; Limet al,2011)。在本研究中，江蘺、滸苔、藻渣和菌渣組魚粉含量為30%，但生長性能均優(yōu)于含45%魚粉的對照組2，并且滸苔組生長顯著高于含60%魚粉的對照組1，表明以江蘺、滸苔、藻渣和菌渣配合植物蛋白替代魚粉能夠促進紅鰭東方鲀生長。這與目前已報道的在飼料中添加海藻可以促進眼斑擬石首魚(Sciaenops ocellatus)、大菱鲆、大黃魚(Pseudosciaena crocea)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)等生長的研究結(jié)果相似(李雅婷等,2016; 盧青等,2015; Asino,2010; 彭素曉等,2017)。

海藻對水產(chǎn)動物生長性能的促進，一方面可能是由于海藻中含有的一些具有誘食作用的物質(zhì)(如DMSP 等)增加了攝食量(鄒仕庚等,2005；王亮,2012)，促進了生長。本研究中，江蘺、滸苔、藻渣和菌渣組攝食率均高于對照組1，說明江蘺、滸苔、藻渣和菌渣對紅鰭東方鲀均能起到一定誘食作用。另一方面，海藻中含有的?；撬峥赡苎a充了陸生植物蛋白替代魚粉后的牛磺酸缺乏。本研究中，江蘺、滸苔、藻渣和菌渣組飼料中魚粉含量為30%，牛磺酸含量卻均不低于含45%魚粉的對照組2，說明江蘺、滸苔、藻渣和菌渣補充了一定的?；撬?，這可能也是江蘺、滸苔、藻渣和菌渣組生長性能并未降低的原因之一。江蘺、滸苔、藻渣和菌渣組飼料必需氨基酸中蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸的含量均低于對照組1和對照組2、苯丙氨酸含量均高于對照組1和對照組2，而江蘺、滸苔和藻渣組生長均優(yōu)于對照組2，這提示江蘺、滸苔和藻渣組中的蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸含量可能基本滿足了紅鰭東方鲀生長，而滸苔組生長最好，可能與滸苔組飼料中最高的苯丙氨酸含量有關(guān)(表3)，具體紅鰭東方鲀對必需氨基酸的需求量有待進一步研究。江蘺、滸苔和藻渣中的海藻多糖對紅鰭東方鲀生長也可能具有促進作用，有研究報道了飼料中添加海藻多糖可以促進珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂) (林建斌等,2017)、黃顙魚(Pelteoobagrus fulvidraco) (楊晴等,2014)、鯽魚(Carassius auratus) (耿中雷等,2017)的生長，由于本研究并未對海藻中的多糖進行測定，因此具體原因還需要進一步研究。而菌渣對紅鰭東方鲀生長的促進可能也與真菌菌體中的多糖有關(guān)，真菌細胞中含有殼聚糖等多糖。有研究表明，飼料中添加殼聚糖可以促進星斑川鰈(Platichthys stellatus)幼魚(王際英等,2013)、俄羅斯鱘(Acipenser gueldenstaedti) (肖艷翼等,2017)生長。

作者之前對江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代大菱鲆飼料中魚粉的研究中，江蘺、藻渣和菌渣可以替代含60%魚粉的對照組中 35%的魚粉而不影響大菱鲆生長，而滸苔組則顯著降低了大菱鲆生長(郭斌等,2018)。滸苔組實驗結(jié)果與本研究中紅鰭東方鲀的實驗結(jié)果不同，可能與紅鰭東方鲀和大菱鲆之間營養(yǎng)需求和消化道組織結(jié)構(gòu)不同等有關(guān)。大菱鲆消化道存在胃、前腸、中腸和后腸的分化，胃黏膜有許多褶皺，有發(fā)達的胃腺(崔龍波等,2008)；紅鰭東方鲀消化道僅有胃與小腸的分化，小腸前、中、后部區(qū)分不明顯，胃不含胃腺，僅有分泌細胞(叢嬌日等,1998)，并且有研究發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀胃中蛋白酶在酸性條件下活性極低，而在pH=6時有峰值(萬蓁蓁,2005)。紅鰭東方鲀生活習性也與大菱鲆不同，紅鰭東方鲀適宜水溫更高，紅鰭東方鲀最適水溫為28℃ (張云等,2010)，而大菱鲆最適水溫為18℃ (李文龍等,2017)，紅鰭東方鲀游動攝食更頻繁，消化速度更快，食物在腸道停留時間更短。紅鰭東方鲀這些生理上的特點可能與其攝食率高、飼料效率低存在聯(lián)系，而本實驗滸苔組生長較好的具體原因還需要進一步研究。

GPT和GOT是魚類氨基酸代謝中的2個關(guān)鍵酶，它們在肝臟中活性的高低反映了氨基酸代謝程度的強弱和肝臟功能的正常與否(嚴俊麗等,2016)。本研究中，江蘺、滸苔、藻渣和菌渣組紅鰭東方鲀肝臟GPT和GOT活性均低于對照組1，但并無顯著差異，說明江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉后雖然改變了飼料中氨基酸的組成，降低了飼料必需氨基酸含量，但并沒有顯著影響紅鰭東方鲀對氨基酸的代謝。正常情況下血清中GPT和GOT含量很少，當肝臟組織受損時，細胞膜通透性發(fā)生改變，GPT和GOT會進入血液，導(dǎo)致血清中GPT和GOT活性上升(嚴俊麗等,2016)。本研究中，江蘺、滸苔和藻渣組血清GPT和GOT均低于對照組1，說明江蘺、滸苔、藻渣替代魚粉對紅鰭東方鲀幼魚的肝臟沒有造成不良影響。MDA是多不飽和脂肪酸被超氧陰離子自由基過氧化而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，具有細胞毒性，在生物體內(nèi)可引起細胞代謝及功能障礙，血清中MDA的含量間接反映組織細胞的氧化損傷程度(周勝強等,2013; Jainet al,2001)。SOD 對機體氧化與抗氧化平衡起著重要作用，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。本研究中，江蘺、滸苔、藻渣和菌渣組血清MDA含量和SOD活性與對照組1和對照組2均無顯著差異，說明江蘺、滸苔、藻渣和菌渣替代魚粉對紅鰭東方鲀魚體的抗氧化能力沒有造成不良影響。

溶菌酶是無脊椎動物非特異性免疫的重要組成部分之一，能通過水解革蘭氏陽性菌細胞壁中的肽聚糖而使之細胞裂解，從而殺滅病原微生物(何瑞鵬等,2017)。本研究中，滸苔、藻渣、菌渣組紅鰭東方鲀血清溶菌酶活性高于對照組1和對照組2，江蘺和滸苔組肝臟溶菌酶活性高于對照組1，說明江蘺、滸苔、藻渣和菌渣對提高紅鰭東方鲀非特異性免疫力具有一定作用，而對照組1、藻渣和菌渣組肝臟溶菌酶活性顯著低于對照組2的原因尚不明確，還需要進一步研究。

4 結(jié)論

將10%的江蘺、滸苔、藻渣和菌渣與植物蛋白質(zhì)配合替代飼料中30%的魚粉對紅鰭東方鲀幼魚的生長性能無不良影響，并且滸苔可以顯著提高紅鰭東方鲀幼魚的生長性能。