李利紅，魏志華，呂樂(lè)園，趙建平，李慧娟

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 制藥工程學(xué)院，河南 鄭州，450046)

板栗(Castanea Mollissima Blume) 為山毛櫸科或殼斗科植物，在我國(guó)南北各地廣泛栽培，約占世界總產(chǎn)量的83%[1]。河南是我國(guó)重要的板栗種植地區(qū)，每年產(chǎn)生大量的板栗殼，但缺乏有效利用。研究表明，板栗殼色素穩(wěn)定、無(wú)毒、清除自由基能力強(qiáng)[2]，具有抗衰老、藥理保健等功能。板栗殼資源豐富，成本低，源于天然，將其開(kāi)發(fā)為綠色飼料添加劑應(yīng)用于畜牧業(yè)，具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)，對(duì)超聲輔助堿法和乙醇法提取板栗殼的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定其中的黃酮類(lèi)和酚類(lèi)成分含量，研究其抑菌活性，為板栗殼的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

板栗購(gòu)自鄭州市姚橋農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，剝?nèi)馊溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

超聲波清洗儀(SYU-22-600DT，鄭州生元儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-1001-VN，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，離心機(jī)(LXJ-IIB，上海安亭科學(xué)儀器廠)，分光光度計(jì)(VIS-7220G，北京瑞利分析儀器公司)，萬(wàn)分之一天平(BT125D，賽多利斯)，立式高壓滅菌鍋(LDZM-60K，上海審安醫(yī)療器械廠)，超凈工作臺(tái)(JH-SCB，上海鴻都電子科技有限公司)，生化培養(yǎng)箱(SPX-300BSH，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器(THZ-Q，太倉(cāng)市華美生化儀器廠)。

沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

試劑：乙醇、氫氧化鈉、沒(méi)食子酸等均為分析純。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)10471，純度98%)，多西環(huán)素原料(河北久鵬制藥有限公司，A201710038)，MH(B)培養(yǎng)基、LB瓊脂、LB培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝的正交設(shè)計(jì) 采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1和表2。

表1 提取的因素及水平

1.3.2 提取流程

(1)超聲輔助乙醇法 稱(chēng)取板栗殼720 g，分成9組，按照表1和表2的設(shè)計(jì)進(jìn)行提取，每組重復(fù)提取三次，離心，過(guò)濾，提取液濃縮，干燥，稱(chēng)重(W)。

(2)超聲輔助堿法 稱(chēng)取板栗殼720 g，分成9組，分別按照表1和表2的設(shè)計(jì)進(jìn)行提取，每組重復(fù)提取三次，離心，過(guò)濾，提取液濃縮，干燥，稱(chēng)重(W)。

表2 正交設(shè)計(jì)

1.3.3 提取物得率計(jì)算 提取物得率 %= W /殼重量×100%。

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱(chēng)取板栗殼150 g，分成3份，按優(yōu)選的超聲輔助乙醇法最佳工藝條件進(jìn)行提?。环Q(chēng)取板栗殼150 g，分成3份，按優(yōu)選的超聲輔助堿法最佳工藝條件進(jìn)行提?。环Q(chēng)取板栗殼150 g，分成3份，按照煎煮法(提取三次，分別為1.5 h，1 h，0.5 h)進(jìn)行提取。

1.3.5 提取物主要成分含量測(cè)定 取1.3.4的提取物進(jìn)行含量測(cè)定。

(1)總酚含量測(cè)定 根據(jù)2010版藥典[3]附錄ⅩB測(cè)定。

(2)總黃酮含量測(cè)定 根據(jù)2010版藥典[3]附錄ⅥD測(cè)定。

1.3.6 抑菌活性 取乙醇法和堿法提取物，按照文獻(xiàn)[4]方法測(cè)定抑菌活性。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件和正交設(shè)計(jì)助手V3.1進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助乙醇法正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 超聲輔助乙醇法提取的得率

由表4可見(jiàn)，根據(jù)極差(R)的大小, 超聲輔助乙醇法工藝參數(shù)中影響板栗殼提取物提取率的4個(gè)因素的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛?A)>提取時(shí)間(C)>提取溫度(B)>溶劑用量(D)。直觀分析得出組合A1B2C2D2的提取率最高，達(dá)5.875%，工藝條件為：乙醇濃度30%，提取溫度25 ℃，提取時(shí)間40 min，溶劑用量8倍,由表5方差分析可知，4個(gè)因素均不具有顯著影響。

表4 超聲輔助乙醇法方差分析

2.2 超聲輔助堿法正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5,方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 超聲輔助堿法提取得率

表6 超聲輔助堿法提取方差分析

由表5可見(jiàn)，根據(jù)極差(R)的大小,超聲輔助堿法工藝參數(shù)中影響板栗殼提取物提取率的4個(gè)因素的主次順序?yàn)椋簆H值(A)>提取時(shí)間(C)>提取溫度(B)>溶劑用量(D)。直觀分析得出組合A1B3C3D3的提取率最高，達(dá)6.738%，工藝條件為：pH=9，提取溫度35 ℃，提取時(shí)間30 min，溶劑用量10倍。由表6方差分析可知，4個(gè)因素均不具有顯著影響。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照優(yōu)選的超聲輔助乙醇法工藝組合A1B2C2D2和超聲輔助堿法工藝組合A1B3C3D3進(jìn)行提取，板栗殼提取物提取得率分別為5.66%(2.83 g)和6.52%(3.26 g)，煎煮法提取得率為4.96%(2.48 g)，超聲輔助乙醇法和堿法提取的得率均比普通煎煮法高。

2.4 板栗殼提取物中主要成分含量測(cè)定

最佳工藝條件下，板栗殼提取物中總酚和總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 板栗殼總酚和黃酮含量

由表7可見(jiàn)，不同工藝條件下，板栗殼提取物的主要成分含量差別很大。堿法提取物中總酚和總黃酮含量均最高，共35.92%，煎煮法提取物含量略低(32.96%)，乙醇法提取物含量最低(20.2%)。

2.5 板栗殼提取物抑菌活性測(cè)定結(jié)果

對(duì)板栗殼提取物的抑菌活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 板栗殼堿提取物的抑菌圈 單位：mm

由表8可看出，板栗殼堿提物對(duì)獸醫(yī)臨床上的常見(jiàn)菌具有一定的抑菌活性，而對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制效果最差。0.1 g/mL提取物對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別達(dá)13 mm、11 mm和13.5 mm；0.1 g/mL的提取物與抗生素11混合使用后，均比同濃度下的抗生素單獨(dú)使用抑菌效果稍好，即提取物與抗生素聯(lián)用，具有增強(qiáng)抗生素抑菌效果的作用。

3 討論

3.1 板栗殼提取物提取工藝研究

研究表明，板栗殼提取物的溶劑從乙醇到乙酸乙酯都有，工藝條件差別較大。周?chē)?guó)燕等用超聲波乙醇提取法的最佳工藝條件為：10倍量40%乙醇、200 W功率超聲波作用時(shí)間8 min，90 ℃提取2.5 h[5]。吳春華等在微波條件下用20倍量40%乙醇，75℃微波輻照13 min,板栗殼提取物的得率為7.02%[6]。曾超珍等板栗殼提取工藝條件為：30倍乙酸乙酯，70 ℃ 浸提4 h[7]。蘇云霞等用15倍68%乙醇、65 ℃提取75 min、粗提物經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂分離和乙酸乙酯-石油醚混合溶液萃取后得板栗殼原花青素。李漢春等用40%乙醇添加0.4%纖維素酶，353 K下提取60 min，提取板栗殼色素[8]。

在不同溶劑和不同工藝條件下，板栗殼提取物中的成分類(lèi)型和含量不同。與文獻(xiàn)相比，本試驗(yàn)以總酚和黃酮為提取對(duì)象，在超聲波條件下采用低濃度乙醇和堿水做溶劑，經(jīng)優(yōu)化，溶劑用量少(8至10倍)、提取時(shí)間短(乙醇法40 min，堿法30 min)，提取溫度低(均不超過(guò)40 ℃)的優(yōu)點(diǎn)，提取物得率大于5%，其中乙醇法提取物中總酚和黃酮量為20.2%，堿法提取物中總酚和黃酮量為35.92%，煎煮法提取物中總酚和黃酮量為32.96%。

3.2 板栗殼提取物抑菌活性研究

周?chē)?guó)燕等發(fā)現(xiàn)板栗殼色素對(duì)枯草芽胞桿菌、大腸桿菌和黑曲霉具有抑制作用，對(duì)蘋(píng)果汁有一定的防腐效果[5]。曾超珍等研究表明，板栗殼提取物有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，能耐短時(shí)的高溫處理，在pH值7～9的范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)大腸桿菌、金色葡萄球菌、枯草桿菌的最低抑菌濃度分別為0.125、0.0625、0.125 mg/mL[7]。韋琴等研究發(fā)現(xiàn)，板栗殼原花青素抑菌效果由大到小依次為:啤酒酵母菌>金黃色葡萄球菌>白色念珠菌，MIC依次為0.120、0.958、3.831 mg/mL[9]。

本試驗(yàn)是在板栗殼提取物對(duì)獸醫(yī)臨床常見(jiàn)菌大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果的基礎(chǔ)上，探討板栗殼提取物與抗生素聯(lián)用的效果，結(jié)果表明，添加板栗殼提取物可以減少抗生素用量，并增強(qiáng)抗生素的抑菌效果。