周家輝，陳濤濤，李芹，史晉絨*，王永明

(1.內(nèi)江師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，四川 內(nèi)江 641112； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 200120)

雙酚A(bisphenol A，BPA)屬雙酚類化合物，是一種內(nèi)分泌干擾素，具有弱雌激素樣及強(qiáng)抗雄激素樣作用[1-4]。BPA可通過(guò)食品包裝材料進(jìn)入食品或飲料中，從而進(jìn)入人體。研究表明， BPA對(duì)人的皮膚、呼吸道、消化道和角膜等有中等強(qiáng)度刺激[1]，胎兒出生前低劑量的BPA暴露會(huì)改變體內(nèi)的生物代謝途徑[5]。稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)，俗稱金白娘、墨線魚(yú)，隸屬于鯉形目、鯉科、鮈鯽屬，為我國(guó)特有小型魚(yú)類，主要自然分布于四川漢源縣、都江堰市、彭州市等地[6]。稀有鮈鯽具有個(gè)體小、易飼養(yǎng)、對(duì)溫度和溶解氧等環(huán)境條件適應(yīng)性強(qiáng)、不易染病、性成熟快、卵透明等優(yōu)點(diǎn)[7]，是化學(xué)品毒性測(cè)試和環(huán)境水樣毒性試驗(yàn)的理想材料[8]。

BPA作為一種內(nèi)分泌干擾物，會(huì)對(duì)機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成一定影響，尤其會(huì)導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)發(fā)育障礙和損傷[9]。BPA對(duì)魚(yú)類早期發(fā)育的影響有諸多報(bào)道，任文娟等[10]使用BPA及其衍生物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎和幼魚(yú)進(jìn)行暴露，結(jié)果顯示斑馬魚(yú)胚胎出現(xiàn)心包水腫、卵黃囊腫、脊柱彎曲和尾部彎曲等癥狀。楊麗華等[11]對(duì)BPA暴露下斑馬魚(yú)幼魚(yú)的神經(jīng)行為進(jìn)行了研究，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的整體平均運(yùn)動(dòng)速率顯著降低。稀有鮈鯽作為一種理想的實(shí)驗(yàn)魚(yú)類，目前尚無(wú)BPA對(duì)其早期發(fā)育影響的報(bào)道。本研究旨在為BPA對(duì)魚(yú)類早期發(fā)育階段的毒性效應(yīng)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)的健康性成熟稀有鮈鯽，飼料(3081)購(gòu)自正大集團(tuán)，試驗(yàn)用水為充氧飽和、24.3±0.3 ℃去離子水，配置25 mg·L-1BPA儲(chǔ)備液備用。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理

選取實(shí)驗(yàn)室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng)的健康性成熟稀有鮈鯽作為親魚(yú)，以雌雄比1∶2飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中(水中溶解氧≥7 mg·L-1)，每日定時(shí)投喂飼料2次，外加豐年蟲(chóng)1次，投喂15 min后及時(shí)吸去殘餌，水溫保持在(26.0±1.0)℃、pH值7.0，光照周期12 h/12 h(光照/黑暗)。通過(guò)晝夜節(jié)律控制，使稀有鮈鯽每日20:00左右產(chǎn)卵。當(dāng)觀察到雄魚(yú)追逐雌魚(yú)，并用頭部頂撞雌魚(yú)腹部等產(chǎn)卵跡象時(shí)，將親魚(yú)撈出，人工干法授精獲取受精卵。受精卵一部分用于試驗(yàn)，剩余部分用于測(cè)定受精率。

1.2.2 胚胎試驗(yàn)

挑選形態(tài)正常、卵徑大小基本一致的胚魚(yú)卵進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置0、2、4、8、16 mg·L-1等5個(gè)濃度BPA處理組和1個(gè)酒精對(duì)照組，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。每個(gè)平行放入胚魚(yú)卵30粒，置于直徑12.0 cm、高2.0 cm有蓋培養(yǎng)皿中，(24.3±0.3)℃培養(yǎng)至受精后96 h。試驗(yàn)期間及時(shí)剔除死亡個(gè)體，每隔24 h更換50%同濃度處理液，記錄胚胎死亡率、孵化率、心率等指標(biāo)。參考文獻(xiàn)[12]，受精卵至肌肉效應(yīng)期前，肉眼觀察到胚胎呈白色，即為死亡；肌肉效應(yīng)期至出膜期，胚體停止擺動(dòng)、心跳消失且半透明胚胎上有一系列不透光的污點(diǎn)出現(xiàn)，即為死亡。

1.2.3 仔魚(yú)試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)設(shè)置0、2、4、6 mg·L-1等4個(gè)濃度BPA處理組和1個(gè)酒精對(duì)照組。將處理液加入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放入10條孵化24 h發(fā)育正常、游動(dòng)迅速的仔魚(yú)，每隔24 h觀察仔魚(yú)死亡率及形態(tài)學(xué)特征，試驗(yàn)期96 h。卵黃囊期仔魚(yú)出現(xiàn)呼吸、心跳停止或缺乏機(jī)械刺激反應(yīng)時(shí)，即為死亡。統(tǒng)計(jì)卵黃囊期仔魚(yú)水腫發(fā)生的嚴(yán)重程度，以水腫面積作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0按照概率單位法計(jì)算處理試驗(yàn)?zāi)┢诘陌霐?shù)致死濃度(LC50)，根據(jù)單因素方差分析法比較差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPA處理稀有鮈鯽胚胎和仔魚(yú)的半數(shù)致死濃度

如表1所示，隨著B(niǎo)PA濃度升高，稀有鮈鯽胚胎和仔魚(yú)的死亡率逐漸增加，BPA對(duì)稀有鮈鯽胚胎和仔魚(yú)的96 h半數(shù)致死濃度分別為10.096、4.237 mg·L-1。

表1 BPA處理稀有鮈鯽胚胎和仔魚(yú)的半數(shù)致死濃度

2.2 BPA對(duì)胚胎期稀有鮈鯽的毒性效應(yīng)

BPA對(duì)稀有鮈鯽胚胎的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為胚胎孵化延遲、孵化率降低、心率不齊等，空白組和對(duì)照組胚胎發(fā)育正常(圖1)。

BPA暴露導(dǎo)致稀有鮈鯽胚胎心率降低、血液循環(huán)減慢。一定濃度范圍內(nèi)，心率隨BPA濃度的升高而下降，16 mg·L-1BPA處理組心率顯著低于其他處理(表2)。BPA暴露導(dǎo)致胚胎孵化延遲甚至無(wú)法出膜，空白組胚胎在96 h內(nèi)基本全部出膜，4 mg·L-1BPA處理組出膜率僅為8%，而8 mg·L-1BPA處理組出膜率為0，所有暴露組均顯著低于空白組。

表2 BPA對(duì)胚胎期稀有鮈鯽孵化率和 胚胎心率的影響

注：胚胎心率為處理36 h時(shí)測(cè)得。同列無(wú)相同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 BPA對(duì)仔魚(yú)期稀有鮈鯽的毒性效應(yīng)

BPA暴露導(dǎo)致稀有鮈鯽仔魚(yú)心包水腫，心率不齊，鰾形成率下降(圖2)?？瞻捉M仔魚(yú)發(fā)育正常無(wú)畸形，而B(niǎo)PA暴露組則出現(xiàn)了不同程度的畸變。

A，空白組仔魚(yú)心包和魚(yú)鰾(SB)發(fā)育正常；B，心包水腫(PCE)；C，魚(yú)鰾未充氣；D，心包水腫(PCE)、鰾未充氣圖2 BPA對(duì)仔魚(yú)期稀有鮈鯽的毒性效應(yīng)

對(duì)BPA處理組仔魚(yú)的心包面積統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，心包水腫面積與劑量成正比，2 mg·L-1BPA處理組仔魚(yú)心包水腫面積與空白組無(wú)顯著性差異，而4、6 mg·L-1BPA處理組水腫面積顯著高于空白組(圖3)。BPA暴露顯著減弱仔魚(yú)的心臟搏動(dòng)，仔魚(yú)心率隨BPA濃度升高而降低。隨著暴露時(shí)間增加，空白組仔魚(yú)心率先降低再升高，其他暴露組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。暴露72 h時(shí)，空白組和2 mg·L-1組全部仔魚(yú)魚(yú)鰾充氣，4、6 mg·L-1組魚(yú)鰾充氣率顯著低于空白組。

圖3 BPA對(duì)仔魚(yú)期稀有鮈鯽心包水腫面積、心率及魚(yú)鰾充氣率的影響

3 討論

BPA對(duì)魚(yú)類的毒性作用主要為內(nèi)分泌干擾和生殖毒性[13-14]。高濃度的BPA暴露會(huì)引起胚胎和仔魚(yú)死亡，16 mg·L-1BPA處理組暴露96 h后稀有鮈鯽胚胎死亡率達(dá)到100%，8 mg·L-1BPA處理組暴露96 h后稀有鮈鯽仔魚(yú)死亡率達(dá)到100%。通過(guò)線性回歸方程分別求得胚胎和仔魚(yú)的半致死濃度為10.096、4.237 mg·L-1，說(shuō)明仔魚(yú)期的稀有鮈鯽對(duì)BPA的毒性反應(yīng)更敏感，這可能是因?yàn)榕咛テ诰哂新涯さ谋Ｗo(hù)，破膜而出的仔魚(yú)身體稚嫩，直接受到毒物侵蝕引起死亡。

孵化是魚(yú)類生命周期開(kāi)始的關(guān)鍵，是一系列生物化學(xué)和物理學(xué)機(jī)制聯(lián)合作用的結(jié)果[15]。研究表明，水溫25.0 ℃條件下培育稀有鮈鯽胚胎34 h后，心臟發(fā)育完全，開(kāi)始搏動(dòng)，75 h孵化出仔魚(yú)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，BPA能夠延遲胚胎發(fā)育，表現(xiàn)出延遲發(fā)育的特征，可能是BPA影響了孵化酶的合成和釋放[13]。物質(zhì)誘導(dǎo)的心率改變可被視為發(fā)育缺陷的表現(xiàn)[16]，無(wú)論胚胎還是仔魚(yú)，隨著B(niǎo)PA濃度升高，出現(xiàn)心跳減緩和心率不齊等癥狀。心包水腫的大小同樣是衡量心臟毒性的一個(gè)重要指標(biāo)[17]，隨著B(niǎo)PA濃度升高和作用時(shí)間增加，心包水腫面積增加，表明BPA的暴露影響了心臟的正常生理功能。BPA暴露對(duì)胚胎期和仔魚(yú)期稀有鮈鯽的心臟均有毒性效應(yīng)，造成心臟發(fā)育缺陷，影響血液循環(huán)，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸，進(jìn)而造成發(fā)育遲緩。

鰾能夠增加魚(yú)體的浮力，使魚(yú)在水中自由活動(dòng)。已有研究表明，光照[18]、水體充氣量[19]、水表面的油膜[20]、鹽度[21]、溫度[22]等均可以引起仔魚(yú)鰾器官發(fā)育異常。本試驗(yàn)中，BPA暴露72 h后，除空白組和2 mg·L-1BPA處理組外，其余BPA暴露組鰾充氣率均顯著降低。