王曉艷，儲(chǔ)著勝，張 輝，張書(shū)琦，潘思源，唐進(jìn)法，高錦明

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)生處，浙江 杭州 310053；4. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450008；5. 香港科技大學(xué)生命科學(xué)部，香港 999077)

高脂血癥是指血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-C)升高或者高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoproteincholesterol，HDL-C)降低的一種脂代謝異常性疾病，亦被稱為脂質(zhì)異常血癥[1]。高脂血癥是諸多疾病的重要誘因，包括動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死等。因此，降脂藥物的開(kāi)發(fā)越來(lái)越受到人們的重視，而制備與臨床疾病相近似、穩(wěn)定性好、可行性高、適用性和可控性強(qiáng)、簡(jiǎn)單易行的適合于降血脂藥物研究，尤其是藥物篩選的動(dòng)物模型尤其重要。目前，制備高脂血癥模型的常用動(dòng)物包括鼠類、兔、豬等，造模方法包括高脂飼料喂養(yǎng)法[2]、脂肪乳劑灌胃法[3]、復(fù)合因素造模法[4]、Triton WR-1339肌肉注射法[5]等。最常用的造模方法是給動(dòng)物喂養(yǎng)高脂飼料，但高脂飼料配方不統(tǒng)一，有的含有化學(xué)藥品。模型主要的表現(xiàn)是血TC升高，而TG升高不明顯，甚至降低，而且制備流程繁瑣和耗時(shí)較長(zhǎng)。

五味子素B(schisandrin B，Sch B)作為傳統(tǒng)中藥五味子中含量最高的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，具有解毒保肝[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]等藥理作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，Sch B(0.1～2 g·kg-1)一次給藥，在12～96 h內(nèi)就能很好地模擬臨床高脂血癥-脂肪肝-肝損傷的發(fā)病過(guò)程，并為降血脂藥非諾貝特所逆轉(zhuǎn)[10-11]。脂質(zhì)代謝組學(xué)是研究脂質(zhì)代謝調(diào)控的新學(xué)科，能夠從系統(tǒng)分子水平上對(duì)生物體內(nèi)的脂質(zhì)類代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，進(jìn)而分析整體脂質(zhì)代謝輪廓的變化[12]。因此，本研究利用脂質(zhì)代謝組學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步闡明Sch B誘發(fā)高甘油三酯血癥小鼠血清脂質(zhì)代謝物的改變，篩選相關(guān)差異代謝物，為新模型提供脂代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-Q/TOF-MS，美國(guó)Waters公司)；真空離心濃縮儀(miVac Duo，英國(guó)GeneVac公司)；分析天平(Mettler Toledo AL204，瑞士梅特勒-托利多公司)；低溫臺(tái)式高速離心機(jī)(Neofuge 1600R，上海力申科學(xué)儀器有限公司)。Sch B，香港科技大學(xué)高錦明教授提供，純度大于95%；甲醇和乙腈均購(gòu)于北京化工廠；氯仿購(gòu)于美國(guó)Sigma；TC試劑盒和TG試劑盒，均購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與給藥ICR小鼠，♂，體質(zhì)量(23～27) g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。高脂/糖飼料配方：基礎(chǔ)飼料80%、豬油10%、果糖10%，加水適量，充分混勻，浸泡過(guò)夜，捏成適當(dāng)大小的塊狀，自然晾干，備用。

小鼠分4組，每組10只，分別為正常飼料(normal diet，ND)組、ND+Sch B組、高脂高糖飼料(high fat/fructose diet，HFFD)組、HFFD+Sch B組。各組小鼠分別用正常飼料和高脂高糖飼料喂養(yǎng)10 d，根據(jù)前期研究結(jié)果，選擇最大效應(yīng)劑量的Sch B(2 g·kg-1，其有效劑量為0.1～2 g·kg-1，一次給藥的最大耐受量大于5 g·kg-1)用橄欖油配制，于d 8灌胃給藥，對(duì)照組用橄欖油(5 mL·kg-1)灌胃。48 h后，小鼠眼眶取血，存放EP管中，靜置2 h，4 ℃、3 500 r·min-1離心8 min，取上部血清，-80 ℃保存。

1.3 生化學(xué)檢測(cè)取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血清TG和TC含量。

1.4 血清樣本前處理與UPLC-Q/TOF-MS分析條件取各組小鼠血清100 μL置1.5 mL離心管中，加入蛋白沉淀劑氯仿 ∶甲醇=3 ∶1(V/V)500 μL，渦旋提取5 min后，常溫靜置10 min，低溫(4 ℃)12 000 r·min-1離心5 min。取上清100 μL，離心濃縮，以100 μL異丙醇 ∶乙腈=1 ∶1(V/V)進(jìn)行復(fù)溶。采用同樣的處理方法制備質(zhì)量控制(quality control，QC)樣本。

色譜分離條件：分離系統(tǒng)中采用色譜柱Waters UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫設(shè)定為50 ℃。流動(dòng)相A為乙腈 ∶水=4 ∶6(V/V)，其中含0.1%甲酸和10 mmol·L-1甲酸銨；流動(dòng)相B為乙腈 ∶異丙醇=9 ∶1(V/V)，其中含0.1%甲酸和10 mmol·L-1甲酸銨。流速：0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量為2.0 μL。采用梯度洗脫，0～1 min，40% B；1～16 min，40%～100% B；16～18 min，100% B；18～20 min，100%～40% B；20～22 min，40% B。

質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)：采用Xevo G2-S Q/TOF-MS質(zhì)譜系統(tǒng)，電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)正負(fù)兩種模式，各氣路均使用氮?dú)?；掃描范圍：m/z 50～1 200，分辨率設(shè)定為30 000。錐孔電壓：35 V；離子源溫度120 ℃；毛細(xì)管電壓：3200V(+)/2500V(-)；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流速：800 L·H-1；圓錐氣流速：50 L·H-1。

1.5 數(shù)據(jù)處理使用Masslynx 4.1數(shù)據(jù)管理軟件采集，將LC/MS分析得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取、色譜峰自動(dòng)識(shí)別、峰匹配等一系列處理，再將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行(正交)偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)。OPLS-DA分析后，取VIP值大于1的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)分析，兩組間樣本比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05的代謝物即可能為潛在的差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 建立高脂血癥動(dòng)物模型Tab 1結(jié)果顯示，ND+Sch B組小鼠血清TG水平是ND組的3.71倍(P<0.01)，TC水平無(wú)明顯變化。與ND組比，HFFD組小鼠血清TC水平明顯升高18.18%(P<0.05)，TG水平無(wú)明顯變化。與HFFD組比，HFFD+Sch B組小鼠血清TG水平是前者的4.17倍(P<0.001)，雖然TC水平升高16.67%，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ND組比，HFFD+Sch B組小鼠血清TG和TC水平分別升高267.46%和37.88%(P<0.01)。

Tab 1 Changes of serum lipids in

*P<0.05,**P<0.01vsND;##P<0.01vsHFFD

2.2 建立脂質(zhì)代謝組學(xué)方法為了盡可能地測(cè)定血清中所有脂質(zhì)成分，采用正負(fù)離子兩種檢測(cè)模式，并對(duì)樣本的提取方法、色譜分離條件和質(zhì)譜檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立的方法可檢測(cè)到血清中磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)、神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、膽甾醇酯(cholesteryl ester)、TG等脂質(zhì)分子。利用ESI正、負(fù)離子模式分別采集各組小鼠血清樣本數(shù)據(jù)，獲取血清樣本的總離子流圖。Fig 1、2顯示，PE主要集中在0～4 min內(nèi)洗脫，PI主要集中在4～8 min內(nèi)洗脫，SM和PC主要集中在8～14 min內(nèi)洗脫，而TG和膽甾醇酯主要集中在15～18 min內(nèi)洗脫。所有代謝物在20 min內(nèi)均能得到很好的分離，且4組的輪廓明顯不同，由此說(shuō)明本研究所建立的脂質(zhì)代謝組學(xué)方法可行，較為全面地反映了各組小鼠血清中的主要脂質(zhì)類成分的變化。

2.3 脂質(zhì)代謝組學(xué)表征用半定量數(shù)據(jù)所得矩陣，建立正交偏最小二乘判別分析模型(OPLS-DA)區(qū)分ND組(a)和ND+Sch B(b)組小鼠的脂質(zhì)代謝輪廓圖。正離子模式下模擬的擬合參數(shù)為R2X=0.940，R2Y=0.981，Q2=0.959；負(fù)離子模式下模擬的擬合參數(shù)為R2X=0.923，R2Y=0.998，Q2=0.960，說(shuō)明擬合得到的模型較好。OPLS-DA模型得分圖見(jiàn)Fig 3A、3C。結(jié)果顯示，ND組和ND+Sch B組存在明顯的區(qū)分，說(shuō)明這2組小鼠的血清脂質(zhì)代謝輪廓圖差異存在顯著性。

采用OPLS-DA區(qū)分ND組(a)、HFFD組(c)、HFFD+Sch B組(d)小鼠的脂質(zhì)代謝輪廓圖，正離子模式下模擬的擬合參數(shù)R2X=0.951，R2Y=0.914，Q2=0.868，說(shuō)明擬合得到的模型較好。負(fù)離子模式下模擬的擬合參數(shù)為R2X=0.890，R2Y=0.807，Q2=0.431。OPLS-DA模型得分圖見(jiàn)Fig 3B、3D。結(jié)果顯示，ND組、HFFD組和HFFD+Sch B組存在明顯的區(qū)分，說(shuō)明這3組小鼠的血清脂質(zhì)代謝輪廓圖差異存在顯著性。

2.4 差異化合物的分析通過(guò)OPLS-DA載荷圖和單因素方差分析尋找Sch B誘導(dǎo)高脂血癥的差異代謝物，依據(jù)代謝產(chǎn)物的精確質(zhì)量數(shù)查詢HMDB(http://www.hmdb.ca)和LIPID MAPS(http://www.lipidmaps.org)等數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異性脂質(zhì)分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ND+Sch B組TG(54 ∶4)、TG(54 ∶3)、TG(52 ∶4)、TG(54 ∶6)、TG(54 ∶2)、TG(54 ∶7)、TG(56 ∶7)、TG(50 ∶3)、TG(56 ∶5)、TG(50 ∶2)、TG(58 ∶8)、TG(56 ∶8)、TG(58 ∶9)、TG(56 ∶4)、TG(58 ∶10)、TG(50 ∶4)、TG(56 ∶3)、TG(52 ∶6)、PC(18 ∶0/18 ∶2)、PC(18 ∶1/18 ∶0)、PC(18 ∶2/16 ∶0)、PC(18 ∶1/20 ∶3)、PC(18 ∶1/16 ∶0)、PC(18 ∶2/0 ∶0)、PC(20 ∶4/16 ∶0)、PE(22 ∶6/0 ∶0)含量高于ND組，PE(18 ∶0/0 ∶0)含量低于ND組；HFFD組SM(d18 ∶1/16 ∶0)、PC(18 ∶1/18 ∶0)、Cholesteryl ester(20 ∶4)、SM(d16 ∶1/20 ∶0)、Cholesteryl ester(22 ∶6)、PC(18 ∶2/P-18 ∶1)、PC(O-16 ∶0/20 ∶4)、PC(22 ∶4/18 ∶1)、PC(18 ∶0/22 ∶5)、SM(d18 ∶2/18 ∶0)、PI(18 ∶0/20 ∶4)、TG(54 ∶1)、SM(d18 ∶2/16 ∶0)、PC(P-16 ∶0/20 ∶4)、SM(d16 ∶1/22 ∶0)、SM(d18 ∶1/20 ∶0)、TG(52 ∶1)、PC(18 ∶1/20 ∶3)、PC(20 ∶4/16 ∶0)、PC(18∶0/18 ∶1)、PC(18 ∶2/18 ∶0)、PC(22 ∶6/18 ∶0)含量高于ND組，TG(54: ∶)、TG(52 ∶4)、TG(54 ∶7)、PC(20 ∶3/0 ∶0)、PC(22 ∶6/0 ∶0)含量低于ND組；HFFD+Sch B組TG(54 ∶3)、TG(52 ∶4)、TG(54 ∶2)、TG(54 ∶6)、PC(18 ∶1/18 ∶0)、TG(52 ∶1)、TG(50 ∶2)、TG(50 ∶3)、TG(54 ∶7)、TG(54 ∶1)、TG(56 ∶5)、TG(56 ∶8)、TG(58 ∶8)、TG(50 ∶4)、TG(56 ∶4)、20 ∶4 Cholesteryl ester、PC(18 ∶2/18 ∶0)、PC(18 ∶1/16 ∶0)、PC(18 ∶0/18 ∶1)、PC(18 ∶2/16 ∶0)、PE(22 ∶6/0 ∶0)、PC(22 ∶6/18 ∶0)、PE(18 ∶2/0 ∶0)、PE(16 ∶0/0 ∶0)含量高于HFFD組，PE(18 ∶0/0 ∶0)含量低于HFFD組。

Fig 1 Chromatogram of serum samples on positive ion mode(n=8)

A: ND group; B: ND+Sch B group; C: HFFD group; D: HFFD+Sch B group.

Fig 2 Chromatogram of serum samples on negative ion mode

A: ND group(n=6); B: ND+Sch B group(n=4); C: HFFD group(n=4); D: HFFD+Sch B group(n=4).

3 討論

目前臨床上將高脂血癥分為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、混合型高脂血癥、低高密度脂蛋白血癥。脂質(zhì)作為生物體內(nèi)重要的化合物，美國(guó)在“脂質(zhì)代謝途徑研究計(jì)劃”中將其分為8類，分別為甘油脂類、鞘脂類、固醇脂類、脂肪酸類、甘油磷脂類、孕烯醇酮脂類、糖脂類、多聚乙烯類[13]。其復(fù)雜多樣性決定了其很難用一種方法將所有脂類物質(zhì)檢測(cè)清楚。脂質(zhì)代謝組學(xué)是目前新興的代謝組學(xué)的一個(gè)分支，其主要針對(duì)機(jī)體內(nèi)所有脂類物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究，應(yīng)用此方法對(duì)相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制的研究更為敏感、完整和準(zhǔn)確，并能進(jìn)一步反映其內(nèi)源性代謝物的量變與質(zhì)變，為包括高脂血癥在內(nèi)的多種代謝性疾病的研究提供了重要手段，同時(shí)也成為評(píng)價(jià)高脂血癥動(dòng)物模型的有效方法。前期研究發(fā)現(xiàn)，Sch B一次大劑量給藥對(duì)小鼠血清TG有明顯的升高作用，并伴有肝細(xì)胞脂肪樣變和肝損傷[11]，具有制備高脂血癥(急性單純性高甘油三酯血癥)動(dòng)物模型的潛力。因此，本實(shí)驗(yàn)借助于脂質(zhì)代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)Sch B誘導(dǎo)的高脂血癥進(jìn)行評(píng)價(jià)，并為該模型的建立提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。作為對(duì)比，同時(shí)模擬人高脂高糖飲食嗜好，在正常飼料的基礎(chǔ)上添加豬油和果糖制備高脂血癥，以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察Sch B對(duì)脂質(zhì)代謝組學(xué)的影響。

UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)因其具有高分辨力、高靈敏度、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，非常適合復(fù)雜生物代謝物的脂質(zhì)組學(xué)的分析，是目前應(yīng)用最為廣泛的分析技術(shù)之一。代謝組學(xué)分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)信息含量豐富，并且是多維數(shù)據(jù)，對(duì)此數(shù)據(jù)的分析需要運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)及多元統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行壓縮降維并歸類分析。常用的分析方法主要包括主成分分析(principal component analysis，PCA)、層次聚類分析(hierarchical clustering analysis，HCA)、非線性影射(nonlinear mapping，NLM)等非監(jiān)督分類方法，以及偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)、OPLS-DA、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(neural network，NN)、k-最近鄰法(k-nearest neighbor，KNN)、隨機(jī)森林分析(random forest analysis，RF)等監(jiān)督分類法。其中以PCA、PLS-DA、OPLS-DA使用最為廣泛。并且OPLS-DA是在PLS-DA基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的算法，與PLS-DA相比較而言，其將X變量中的系統(tǒng)變異分解為兩部分，隨著正交變異組分的增加，將提供更多的解釋性和減少結(jié)果的誤差。本實(shí)驗(yàn)采用監(jiān)督模式的OPLS-DA分析，在明確樣品分類的情況下，其分類效果比PCA更好。本研究結(jié)果證明，Sch B建立的高甘油三酯血癥與高脂高糖飲食引起的高膽固醇血癥，在脂代謝組學(xué)方面有明顯的不同。

Fig 3 OPLS-DA score plots of serum samples

A and B represent the score plots on positive ion mode; C and D represent the score plots on negative ion mode. a: mice fed with ND; b: mice fed with ND and treated with Sch B; c: mice fed with HFFD; d: mice fed with HFFD and treated with Sch B.

通過(guò)對(duì)比高分辨的質(zhì)量數(shù)和相關(guān)質(zhì)譜碎片裂解信息，并結(jié)合HMDB、METLIN、LIPID MAPS等數(shù)據(jù)庫(kù)，確定可能的歸屬和結(jié)構(gòu)鑒定，篩選Sch B誘導(dǎo)高甘油三酯血癥的差異代謝物。與生化檢測(cè)結(jié)果中HFFD組小鼠血清TG水平與ND組無(wú)明顯差異結(jié)果不同，脂質(zhì)代謝組學(xué)顯示出其代謝特征存在明顯不同。進(jìn)一步說(shuō)明與生化試劑盒檢測(cè)方法相比，脂質(zhì)代謝組學(xué)能更敏感、更完整、更準(zhǔn)確地反映其內(nèi)源性脂代謝物的量變，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。

綜上所述，該模型制備操作簡(jiǎn)便，Sch B一次灌胃在12～96 h內(nèi)便可復(fù)制臨床高脂血癥-脂肪肝-肝損傷的發(fā)病過(guò)程。克服高脂飼料喂養(yǎng)造模的繁瑣和模型不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，并能根據(jù)研究需要通過(guò)劑量的加減來(lái)控制模型的嚴(yán)重程度。Sch B單獨(dú)給藥升高血TG水平，可制備高甘油三酯血癥動(dòng)物模型。聯(lián)合高脂高糖飲食可同時(shí)升高血TG和TC水平，制備混合型高脂血癥動(dòng)物模型。本文通過(guò)脂質(zhì)代謝組學(xué)的研究，豐富了Sch B制備高甘油三酯血癥動(dòng)物模型的內(nèi)涵和理論基礎(chǔ)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室和河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)