鄭紅星，黃潔茹，祁珊珊，陳 琛，何 佳，趙 婷，浦井非，趙 曼

(陜西理工大學(xué)1. 生物科學(xué)與工程學(xué)院、2. 中德天然產(chǎn)物研究所、3. 維生素D生理與應(yīng)用研究所，陜西 漢中 723000)

骨質(zhì)疏松是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，糖尿病患者中有50%合并骨質(zhì)疏松癥[1-2]。糖尿病性牙槽骨丟失是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為牙槽骨骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損，骨脆性增加，骨密度降低，易發(fā)骨折[3]。紅景天是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥紅景天的活性成分，具有抗氧化、抗炎、降血糖、神經(jīng)保護(hù)等諸多功效[4-6]。我們前期的研究表明，其對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松癥具有保護(hù)作用[7]，但其對(duì)糖尿病性牙槽骨丟失是否具有保護(hù)作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紅景天提取物(含紅景天苷20%)干預(yù)治療，觀察糖尿病大鼠牙槽骨結(jié)構(gòu)變化及相關(guān)骨代謝因子的變化，探討其對(duì)糖尿病大鼠牙槽骨丟失的影響，以期為糖尿病性牙槽骨丟失的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)3月齡♀未孕SD大鼠40只，體質(zhì)量(230～246) g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。分籠飼養(yǎng)，自由飲水，動(dòng)物房溫度(22～26) ℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器紅景天提取物(其中紅景天苷含量20%)，購(gòu)自陜西森弗天然制品有限公司；鏈脲佐菌素，購(gòu)自阿拉丁公司；鈣標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自Sigma公司；大鼠堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、核因子NF-κB配體的受體激活劑(receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand，RANKL)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程公司。血糖計(jì)、血糖試紙(羅氏公司)；酶標(biāo)儀(Biotek)；AAS-900T原子吸收光譜儀(美國(guó)PE公司)；RM2235病理組織切片機(jī)(Leica公司)；高速離心機(jī)(Eppendorf)。

1.3 糖尿病大鼠模型的構(gòu)建將大鼠禁食12 h，腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(60 mg·kg-1)，于造模后3 d及造模后1周，所有大鼠于尾靜脈采血，測(cè)定全血血糖并記錄。若2次血糖值均≥16.7 mmol·L-1，表明糖尿病造模成功?？瞻捉M大鼠給予檸檬酸緩沖液腹腔注射。

1.4 動(dòng)物分組及給藥糖尿病模型構(gòu)建成功后，對(duì)上述動(dòng)物進(jìn)行重新分組，分別為空白組(Control)、模型組(Model)、紅景天組(RRE)，每組10只，紅景天組灌胃給予紅景天提取物150 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥8周。

1.5 血清生化檢測(cè)大鼠給藥8周末，尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖，腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉麻醉后，采集眼眶靜脈血，4 000 r·min-1離心10 min，分離血清，分別按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清ALP、OPG、RANKL，采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算OPG/RANKL比值。

1.6 血鈣檢測(cè)采用火焰原子吸收法進(jìn)行血鈣測(cè)定。鈣稀釋液 ∶鹽酸 ∶乙二醇：水以體積比0.5 ∶5 ∶94.5混合。供試樣：吸取60 μL血清加到5.94 mL鈣稀釋液中；空白樣：5.94 mL鈣稀釋液。按儀器工作條件測(cè)定空白、標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣的吸光度，儀器自動(dòng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。

1.7 骨組織病理分析給藥第8周末，頸椎脫臼處死大鼠，取各組大鼠牙槽骨，固定于4%多聚甲醛24 h后，經(jīng)10% EDTA(pH 8.0)脫鈣28 d，常規(guī)脫水并進(jìn)行石蠟切片(5 μm)，HE染色，顯微觀察各組大鼠牙槽骨結(jié)構(gòu)、骨小梁寬度、骨小梁分離度等。

1.8 破骨細(xì)胞的組織化學(xué)染色采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)法[9]對(duì)牙槽骨組織石蠟切片進(jìn)行組織化學(xué)染色，觀察并計(jì)數(shù)牙槽骨中破骨細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖、血清ALP和Ca檢測(cè)結(jié)果如Tab 1所示，模型組血糖、血清ALP較空白組明顯升高(P<0.01)，血清Ca均較空白組明顯降低(P<0.05)；給予紅景天提取物8周后，大鼠血糖、血清ALP水平較模型組明顯降低(P<0.01)，血清Ca水平較模型組明顯升高(P<0.05)。

2.2 各組大鼠血清OPG、RANKL檢測(cè)結(jié)果如Tab 2所示，模型組大鼠血清OPG水平較空白組明顯降低(P<0.01)，給予紅景天提取物8周后血清OPG較模型組升高。RANKL的檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組血清RANKL水平較空白組明顯增加(P<0.01)，給予紅景天提取物8周后血清RANKL水平較模型組降低，且紅景天組與空白組血清RANKL差異無(wú)顯著性(P>0.05)。各組大鼠血清OPG/RANKL比值統(tǒng)計(jì)結(jié)果的變化趨勢(shì)與OPG的變化趨勢(shì)一致。

Tab 1 Levels of blood glucose, serum ALP, Ca in all experimental groups after 8 weeks of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 2 Changes of serum OPG, RANKL levels and OPG/RANKL ratios in rats of experimental group

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.3 牙槽骨組織病理學(xué)觀察結(jié)果如Fig 1所示，空白組牙槽骨形態(tài)結(jié)構(gòu)緊密；與空白組相比，糖尿病大鼠牙槽骨邊緣見(jiàn)到活躍的破骨細(xì)胞性骨吸收陷窩，可見(jiàn)骨細(xì)胞呈扁平或星形，胞質(zhì)嗜堿性，頜骨骨小梁較細(xì)小，髓腔顯得寬大，骨小梁排列稀疏、變細(xì)變薄，間距增大，結(jié)構(gòu)紊亂。紅景天治療組可見(jiàn)骨質(zhì)疏松有所改善，頜骨內(nèi)骨小梁變粗變大呈片狀，交織成網(wǎng)狀，斷裂、吸收現(xiàn)象改善，骨細(xì)胞細(xì)密，分布均勻。

如Fig 2所示，破骨細(xì)胞由多核巨細(xì)胞組成，經(jīng)TRAP染色后呈紅色或暗紅色，主要分布于骨髓腔邊緣。經(jīng)破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，模型組每高倍視野下破骨細(xì)胞數(shù)量較空白組明顯增加，紅景天治療組破骨細(xì)胞數(shù)較模型組降低(P>0.05)，見(jiàn)Fig 3。

Fig 1 Alveolar bone tissue morphology of rats in each group(HE staining×200)

A: Control group; B: Model group; C: RRE group. T refers to trabecular bone.

Fig 2 TRAP stain of osteoclasts in alveolar bone of rats in each group(TRAP staining×400)

A: Control group; B: Model group; C: RRE group. The arrow points to the osteoclasts.

Fig 3 Number of osteoclasts in alveolar bone of rats in each group

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3 討論

糖尿病牙槽骨骨質(zhì)疏松是全身系統(tǒng)性骨質(zhì)疏松的一個(gè)表現(xiàn)，它與牙周病、牙松動(dòng)、牙脫落、口腔種植等口腔病變有密切的關(guān)系[10]。本次實(shí)驗(yàn)采用鏈脲佐菌素腹腔注射法構(gòu)建的糖尿病性牙槽骨損傷大鼠模型，從牙槽骨組織形態(tài)及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果可以看出，模型組牙槽骨骨小梁的微觀形態(tài)呈現(xiàn)出骨小梁稀疏、變薄變窄，骨小梁間距明顯增大，說(shuō)明牙槽骨微觀結(jié)構(gòu)被破壞，模型構(gòu)建成功。

本研究通過(guò)建立鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的牙槽骨丟失模型，發(fā)現(xiàn)紅景天提取物對(duì)于糖尿病性牙槽骨丟失具有保護(hù)作用，通過(guò)組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，其可有效治療糖尿病性牙槽骨丟失，模型大鼠給予紅景天提取物8周后，牙槽骨結(jié)構(gòu)明顯改善，牙槽骨破骨細(xì)胞數(shù)量明顯降低。血糖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其具有明顯降血糖功效，這與以往報(bào)道一致。

血清骨代謝檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，紅景天提取物給藥8周后，血清Ca、OPG含量明顯增加，血清ALP、RANKL水平較模型組明顯降低。ALP存在于成骨細(xì)胞中，可通過(guò)分解磷酸酯的無(wú)機(jī)磷促進(jìn)骨礦物質(zhì)沉積，骨形成與ALP的活性度相關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組ALP含量高于正常對(duì)照組，說(shuō)明骨組織中骨轉(zhuǎn)換加快，紅景天治療后ALP水平降低，表明紅景天提取物可抑制骨轉(zhuǎn)換。

OPG-RANKL雙分子系統(tǒng)是一個(gè)在生理和病理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生成和骨吸收的關(guān)鍵因子，OPG是破骨細(xì)胞生成抑制因子，RANKL是破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子。血清OPG以及OPG/RANKL比值升高時(shí)，說(shuō)明骨形成增加而骨吸收減少[12-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型大鼠OPG水平及OPG/RANKL比值降低，給予紅景天治療后，OPG水平及OPG/RANKL比值升高。上述結(jié)果證實(shí)紅景天提取物對(duì)糖尿病性牙槽骨損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)OPG/RANKL系統(tǒng)以及ALP，從而促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。