孔慶明，戴方偉，丁豪杰，鄭清四，盧領(lǐng)群，卓洵輝，樓 琦，樓 滌，鄭 斌，丁建祖，褚曉峰，陸紹紅

(1. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所，2. 浙江省實驗動物中心，浙江 杭州 310013；3. 桂林南藥股份有限公司，廣西 桂林 541004；4. 浙江省實驗動物公共服務(wù)平臺，浙江 杭州 310013)

肝纖維化是肝臟對病毒、寄生蟲感染、酒精濫用、代謝性疾病等各種病因所引起的慢性損傷的一種反應(yīng)，是各種慢性肝病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)，也是肝硬化形成的必經(jīng)階段[1]。血吸蟲病是一種流行廣泛、嚴(yán)重危害人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展的人獸共患寄生蟲病。血吸蟲尾蚴感染宿主后，雌性成蟲所產(chǎn)蟲卵大部分沉積于肝、腸等組織中，在與機體相互作用的過程中形成蟲卵肉芽腫、組織損傷和繼發(fā)性肝纖維化。肝纖維化是導(dǎo)致血吸蟲病患者門脈高壓、腹水、上消化道出血等嚴(yán)重并發(fā)癥與死亡的最根本原因[2]。肝纖維化是一個可逆的病理過程，去除致病因素可以明顯減輕肝纖維化，使肝臟功能恢復(fù)正常。如果不加以治療，肝纖維化會轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不痆3]。對浙江嘉興市吡喹酮救治的晚期血吸蟲病患者隨訪發(fā)現(xiàn)，血吸蟲病肝纖維化指標(biāo)異常者仍然高達75.4%，徹底殺蟲治療并不能中止血吸蟲病肝纖維化的進展[4-5]。雖然抗肝纖維化藥物相關(guān)研究取得了一些進展，但是目前臨床尚無理想的抗肝纖維化特效藥物。

青蒿琥酯(artesunate，ART)是一種高效抗瘧藥，也是有效的血吸蟲病預(yù)防藥物。國內(nèi)研究表明，ART能抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)增殖，具有抗四氯化碳致大鼠肝纖維化以及大鼠免疫性肝纖維化作用[6-8]。殼多糖酶在上皮細(xì)胞功能失調(diào)、免疫細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)與纖維化生成中起重要作用[9]。另外，ART可抑制p-ERK1/2的表達[10]，提示ART抗肝纖維化的作用可能與抑制ERK通路有關(guān)。本研究擬以血吸蟲性肝纖維化小鼠為動物模型，隨機分為ART高、低劑量治療組、模型組和正常組，以肝組織病理形態(tài)觀察，結(jié)合透明質(zhì)酸(hyaluronic acid， HA)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)和Ⅲ型膠原α1(collagen type Ⅲ alpha 1，Col3α1)等分子指標(biāo)，綜合評估治療前后的肝纖維化進程；通過肝組織中殼多糖酶3樣蛋白1(chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)等的表達調(diào)控，探討ART通過CHI3L1/ERK通路，改善血吸蟲性肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6周齡ICR清潔級♀小鼠，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2014-0001，使用許可證號：SYXK(浙)2014-0008。日本血吸蟲感染釘螺，購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2 藥物、試劑與儀器青蒿琥酯粉劑(批號：170204)，由桂林南藥股份有限公司惠贈；吡喹酮(批號：170306)，上海新華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，使用0.04 mol·L-1的羧甲基纖維素鈉配制成混懸液備用。HE染色試劑盒(批號：G1120)、Masson染色試劑盒(批號：G1345)，購自上海索萊寶生物科技有限公司；PCR引物，由上海生工生物工程公司合成；TGF-β1抗體(Abcam公司，貨號ab92486)；抗ERK(貨號4695)、p-ERK抗體(貨號4370)，均購自CST公司；CHI3L1抗體(上海生工，貨號D120410)；β-actin抗體(Servicebio，貨號GB12001)。ADVIO 2400全自動血清生化分析儀(拜耳中國有限公司)；CFX96TM熒光定量PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司)。

1.3 肝纖維化小鼠模型的建立與實驗分組小鼠經(jīng)腹部剃毛貼片感染日本血吸蟲尾蚴，建立動物模型，每只感染(20±2)條尾蚴。24只清潔級小鼠隨機分為4組，包括正常組、模型組、ART高、低劑量治療組(50、25 mg·kg-1·d-1)。各組在感染血吸蟲尾蚴7周后，進行連續(xù)3 d的吡喹酮灌胃殺蟲，劑量為180 mg·kg-1·d-1。根據(jù)《日本血吸蟲病肝纖維化診斷與療效評估方案》說明，抗纖維化藥物治療在感染后16周開始，每天灌胃給藥，連續(xù)8周，停藥后4周處死小鼠，取肝臟備用。

1.4 血清肝纖維化指標(biāo)檢測采用全自動血清生化分析儀檢測血清HA、Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，CIV)和血清層黏連蛋白(laminin，LN)。

1.5 肝臟組織病理學(xué)觀察肝組織經(jīng)福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)組織切片，進行HE染色和Masson染色觀察。根據(jù)《日本血吸蟲病肝纖維化診斷與療效評估方案》的規(guī)定，結(jié)合《肝纖維化診斷及療效評估共識》，對肝臟的炎癥與纖維化程度進行半定量計分。

1.6 肝纖維化與CHI3L1/ERK通路相關(guān)基因的qPCR與Western blot檢測無菌刀片于干冰上，將組織樣品切割成約3 mm×3 mm×3 mm大小，置于裝有1 mL TRIzol裂解液的1.5 mL EP管中。將超細(xì)勻漿機工作頭浸入TRIzol裂解液中5～10 s滅活RNA酶后，組織研磨。參照TRIzol試劑盒步驟抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green實時熒光定量PCR兩步法檢測小鼠肝組織內(nèi)纖維化與ERK信號通路相關(guān)基因：平滑肌肌動蛋白α2(alpha-actin-2，ACTA2)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、TGF-β1、CHI3L1、Col3α1、TIMP-1、ERK1/2(MAPK1、MAPK3)的mRNA表達水平，以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt相對定量法處理數(shù)據(jù)。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers for qPCR

取各組肝組織提取總蛋白，Bradford法測定蛋白含量?？偟鞍鬃冃? min后進行Western blot實驗。TGF-β1、ERK、p-ERK、CHI3L1抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1 ∶3 000)，以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 ART對小鼠血清肝纖維化指標(biāo)的影響Tab 2結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清HA水平明顯升高(P<0.01)，含量大于1 mg·L-1。與模型組(HA以1 mg·L-1計算)比較，ART組小鼠血清HA水平呈降低趨勢，高劑量組小鼠血清HA水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，各組小鼠血清CIV和LN水平無明顯變化。

GroupHACⅣLNControl171.43±21.25??99.90±47.2681.89±8.38Model>1000.0068.01±14.5653.03±13.93ART-25751.40±217.0064.97±16.1277.55±12.34ART-50264.80±57.62??91.04±51.6565.50±5.39

**P<0.01vsmodel

2.2 肝、脾形態(tài)與肝組織病理學(xué)指標(biāo)分析正常組小鼠的肝脾顏色、體積、質(zhì)地正常。模型組小鼠肝脾臟器顏色深紫，質(zhì)地粗糙，脾臟體積明顯增大。ART組小鼠肝脾形態(tài)有所改善(Fig 1A)，尤其高劑量給藥組。Tab 3結(jié)果顯示，正常組小鼠脾質(zhì)量指數(shù)與模型組比較明顯減小，差異具有顯著性(P<0.01)。ART高劑量組小鼠的脾臟質(zhì)量指數(shù)與模型組比較明顯減小，差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 1B的HE染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞索排列紊亂，可見界板及中央靜脈周圍肝細(xì)胞壞死及較多炎癥細(xì)胞浸潤；匯管區(qū)結(jié)締組織不同程度增生擴大，向小葉內(nèi)延伸，將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團。ART組的病理損害均減輕。Fig 1C的Masson染色顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織膠原增生明顯，并與鄰近匯管區(qū)及肝靜脈相連，纖維間隔較厚。ART組匯管區(qū)及小葉內(nèi)、小葉間膠原纖維間隔減少、變細(xì)。各組小鼠肝纖維化、炎癥分期見Tab 3，ART高劑量組肝纖維化評分較正常組下降超過2分，說明ART治療血吸蟲性小鼠肝纖維化有效。

Tab 3 Effects of artesunate against liver fibrosis

**P<0.01vsmodel

2.3 ART對血吸蟲性肝纖維化小鼠肝組織CHI3L1/ERK信號通路的影響qPCR檢測結(jié)果顯示(Fig 2A)：與正常組比較，模型組小鼠肝纖維化評估指標(biāo)TIMP-1、Col3α1 mRNA表達明顯增加(P<0.01)，ERK通路相關(guān)分子ACTA2、CTGF、TGF-β1、ERK1/2(MAPK1、MAPK3)的mRNA表達量也升高，其中，CHI3L1和ERK1/2基因的表達量升高差異具有顯著性(P<0.01)。Western blot結(jié)果也顯示(Fig 2B)，與正常組比較，模型組中CHI3L1、TGF-β1蛋白的表達以及ERK1/2蛋白的磷酸化水平明顯升高，血吸蟲肝纖維化發(fā)生過程中，ERK通路被激活。給予ART干預(yù)后，與模型組相比，ART組小鼠肝臟TIMP1、Col3α1 mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)，

Fig 1 Hepatic pathology changes of artesunate against liver fibrosis in Schistosoma japonicum infection

Fig 2 Effects of artesunate on expression of CHI3L1/ERK pathway in liver fibrosis induced by Schistosoma japonicum

A: Real-time PCR; B: Western blot.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

ART高劑量組小鼠肝臟ERK通路相關(guān)分子ACTA2、CTGF、TGF-β1、CHI3L1和ERK1/2表達量降低，其中CHI3L1和ERK1/2基因的表達量的降低具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，ART組中CHI3L1、TGF-β1蛋白的表達水平以及ERK1/2蛋白的磷酸化水平明顯降低，說明ERK信號通路被抑制，ART能夠通過CHI3L1/ERK信號通路介導(dǎo)抗血吸蟲性肝纖維化。

3 討論

理想的動物模型在肝纖維化病理和藥效評價等方面具有重要的意義。病毒、酒精、飲食和血吸蟲是導(dǎo)致人類肝纖維化的主要病因，前幾種病因至今尚無理想的動物模型，尤其無法復(fù)制與臨床情況相似的肝纖維化動物模型。大鼠是日本血吸蟲的半適宜宿主，大鼠體內(nèi)的蟲體不能或較難發(fā)育為成蟲，所以在肝臟較難觀察到蟲卵引起的病變[11]。兔子是日本血吸蟲的適宜性宿主，但是日本血吸蟲感染兔的晚期肝纖維化緩慢可逆[12]。小鼠感染血吸蟲后，其肝臟在蟲卵肉芽腫機械性、炎性因子和細(xì)胞因子等綜合因素作用下，能夠形成與血吸蟲病患者肝纖維化相似的發(fā)病進程，是目前研究日本血吸蟲病肝纖維化發(fā)病機制及藥物防治較為理想的實驗動物模型[13]。本研究以日本血吸蟲感染方式構(gòu)建了小鼠肝纖維化模型，該模型具有一次處理即可成模、纖維化病變與臨床相似、模型可標(biāo)準(zhǔn)化、經(jīng)濟等特點，適用于肝纖維化發(fā)生機制的研究。研究中，模型組血清肝纖維化指標(biāo)HA和脾臟質(zhì)量指數(shù)較正常組變化差異有顯著性，肝組織HE和Masson染色病理分析證實肝纖維化已形成。

抑制HSC的活化與增殖是預(yù)防和治療肝纖維化的主要策略之一。ART是青蒿素的衍生物，體外實驗表明，ART能夠使活化的HSC發(fā)生凋亡[14]，促凋亡機制是通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生及激活或抑制一些信號通路，從而發(fā)生一定的級聯(lián)效應(yīng)。目前，ART可作用于HSC中TGF-β1/Smad、NF-κB、Wnt/β-catenin及TNF-α等介導(dǎo)的信號通路[14]。研究顯示，多細(xì)胞寄生蟲或含有殼多糖的病原體刺激上皮細(xì)胞分泌的殼多糖酶樣蛋白CHI3L1在炎癥與組織重塑中起著極其重要的作用，是巨噬細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志[15]，被激活的巨噬細(xì)胞進一步活化HSC，并使之出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化，激活后的HSC可自分泌TGF-β1等細(xì)胞因子使活化得以持續(xù)，最終導(dǎo)致纖維化。本研究以血吸蟲性肝纖維化小鼠為動物模型，探究了ART體內(nèi)抗肝纖維化的作用。模型組肝臟中維持細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解動態(tài)平衡的關(guān)鍵因子TIMP-1和Col3α1表達明顯增加，ART處理后兩因子表達量明顯降低。與模型組比較，ART處理后小鼠肝臟CHI3L1和ERK1/2蛋白的磷酸化水平明顯降低，說明ART可能通過抑制CHI3L1/ERK信號通路介導(dǎo)抗血吸蟲性肝纖維化。

綜上所述，ART在體內(nèi)對血吸蟲性肝纖維化具有保護作用，其機制可能與膠原蛋白合成抑制以及CHI3L1/ERK信號通路的傳導(dǎo)抑制有關(guān)。本研究為ART抗肝纖維化的藥物研究提供了新的理論基礎(chǔ)。

(致謝：感謝中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所惠贈吡喹酮。感謝浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室和浙江省醫(yī)學(xué)生物工程疫苗重點實驗室的老師、同學(xué)對本研究的支持與協(xié)助。)