陳瑞喜,王璐璐,+,陳德蓉,雷芳萍,楊學(xué)山,2,祝 霞,2,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室,甘肅蘭州 730070)

甘肅省河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)因其得天獨厚的地理條件(北緯36～40°),非常適合釀酒葡萄的栽培,釀酒葡萄種植面積超過30萬畝,年產(chǎn)量達(dá)2.41萬噸[1]。與此同時,釀酒后葡萄皮渣的產(chǎn)量也逐年增長[2],大部分酒廠將皮渣直接廢棄或閑置堆積,只有少量用作田間肥料、動物飼料或當(dāng)燃料處理,不僅造成資源的大量浪費,同時對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[3]。

葡萄釀酒后的皮渣主要由葡萄皮(78%)和葡萄籽(16%)組成,含有大量多酚化合物、芳香化合物、葡萄籽油和膳食纖維等許多高營養(yǎng)價值的化合物[4-5]。研究表明,多酚類物質(zhì)具有抗氧化和清除自由基的特性,對癌癥、糖尿病和動脈粥樣硬化等疾病的預(yù)防具有積極作用[6-7],多酚提取物的抗氧化效果為VC的50倍,VE的20倍[8-10],具有較強(qiáng)的資源化開發(fā)潛力。多酚化合物的提取多采用有機(jī)溶劑提取法,該方法溶劑消耗量大,操作費時,且提取物中含有溶劑殘留,使多酚化合物的實際應(yīng)用受到限制[11]。超聲波是一種彈性機(jī)械波,其萃取效果主要取決于它在溶劑中產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng),能夠使溶劑最大程度地滲透到樣品基質(zhì)中,增加固相和液相之間的接觸面積,從而使樣品中的有效成分迅速溶解到溶劑中[12-13];生物酶能夠水解植物纖維等組織,破壞植物細(xì)胞壁,進(jìn)而充分釋放細(xì)胞內(nèi)含物,有利于植物生物活性物質(zhì)的提取,從而提高葡萄皮渣的利用價值[14]。超聲波輔助酶法可使生物活性成分提取過程更加簡單有效,并能有效提高提取的安全性,但目前采用超聲波輔助酶法提取葡萄酒皮渣中多酚的研究還未見報道。

本實驗以甘肅河西走廊產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄主栽品種赤霞珠(Cabernet Sauvignon)釀酒后的皮渣為原料,對超聲波輔助酶法提取多酚的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,以期確定最佳提取工藝參數(shù),為葡萄酒皮渣資源的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄酒皮渣 于2017年11月采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院葡萄酒生產(chǎn)車間酒精發(fā)酵結(jié)束后皮渣;纖維素酶 酶活力400 U/mg,上海源葉生物科技有限公司;Folin-Ciocalteus顯色劑 北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉 天津市百世化工有限公司;無水碳酸鈉 天津開發(fā)區(qū)海光化學(xué)制藥廠;沒食子酸 上海鼓臣生物科技有限公司。

SCIENTZ IID型超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TU-1810紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;TD5A-WS臺式低速離心機(jī) 東莞康潤實驗科技有限公司;CPJ214電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;恒溫水浴箱 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄皮渣預(yù)處理 將酒精發(fā)酵結(jié)束后的赤霞珠葡萄酒皮渣經(jīng)手工去籽后,置于鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃干燥24 h,粉碎機(jī)粉碎后得到葡萄皮粉末作為實驗原料備用。

1.2.2 單因素實驗設(shè)計

1.2.2.1 超聲時間對多酚得率的影響 準(zhǔn)確稱取預(yù)先處理好的葡萄酒皮渣粉各0.500 g并溶于40 mL水中,加入纖維素酶25 mg,設(shè)置超聲功率300 W,超聲時間分別為5、10、15、20、25 min,在酶解溫度60 ℃、pH5.5的條件下酶解2.5 h。測定多酚得率，選出較佳超聲時間。

1.2.2.2 超聲功率對多酚得率的影響 超聲時間10 min,設(shè)置超聲功率分別為100、200、300、400、500 W,其他操作同1.2.2.1。測定多酚得率,選出較佳超聲功率。

1.2.2.3 酶解pH對多酚得率的影響 在超聲時間10 min,超聲功率300 W,酶解溫度60 ℃的條件下,調(diào)節(jié)酶解pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,其他操作同1.2.2.1。測定多酚得率,選擇較佳酶解pH。

1.2.2.4 酶解溫度對多酚得率的影響 在超聲時間10 min、超聲功率300 W、酶解pH5.5的條件下,設(shè)置酶解溫度分別為50、55、60、65、70 ℃,其他操作同1.2.2.1。測定多酚得率,選出較佳酶解溫度。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取超聲時間、超聲功率、酶解pH、酶解溫度為實驗因素,采用L9(34)正交表,做四因素三水平正交實驗。通過測定各組樣品多酚得率,選出最佳工藝條件。試驗因素和水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 葡萄皮渣多酚的測定 采用福林-肖卡法[15]測定葡萄皮渣多酚。吸取1 mL樣品溶液,加入5 mL蒸餾水、1 mL Folin-Ciocalteus顯色劑和3 mL 7.5% Na2CO3溶液。陰暗處室溫條件下放置2 h顯色后,在765 nm波長下測定吸光度,再根據(jù)總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=0.0775x+0.0032,R2=0.9985)計算樣品中多酚的得率。葡萄酒皮渣中多酚得率按以下公式計算:

式中,ω為多酚得率,%;C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的多酚質(zhì)量濃度,μg/mL;V為提取液的體積,mL;m為葡萄皮渣的質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)并作圖,結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 超聲時間對多酚得率的影響 由圖1可知,不同超聲時間對葡萄皮渣中多酚得率影響顯著(p<0.05),隨著超聲時間的延長,葡萄皮渣中多酚得率增加,在超聲10 min時達(dá)到最大值(1.304%),之后超聲時間再增加,多酚得率顯著下降。這表明當(dāng)超聲時間達(dá)到10 min時,葡萄皮渣中多酚化合物已充分浸出,提取量接近飽和,繼續(xù)延長超聲時間可使更多雜質(zhì)溶出,加速多酚氧化,增加提取成本,并使葡萄皮渣中多酚得率減小[16]。因此,超聲時間宜選用10 min。

圖1 超聲時間對多酚得率的影響Fig.1 Effect of the ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.1.2 超聲功率對多酚得率的影響 不同的超聲功率對葡萄皮渣多酚得率的影響較大。如圖2所示,隨著超聲功率的不斷增大,葡萄皮渣中多酚得率也隨之增加,當(dāng)超聲功率為300 W時,多酚得率最高。當(dāng)超聲功率超過300 W時,多酚得率呈顯著下降(p<0.05)。這主要是由于超聲功率的大小會直接影響超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)。當(dāng)超聲功率增大時,其機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng),從而增大介質(zhì)分子的運動速度、強(qiáng)化介質(zhì)的擴(kuò)散、傳播,使多酚物質(zhì)充分溶出,增加得率[17]。但當(dāng)超聲功率過大,其強(qiáng)烈的空化效應(yīng)易破壞目標(biāo)產(chǎn)物,局部高溫易使多酚氧化分解,進(jìn)而使多酚得率下降[11]。后續(xù)實驗選擇超聲功率300 W為宜。

圖2 超聲功率對多酚得率的影響Fig.2 Effect of the ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.1.3 酶解pH對多酚得率的影響 如圖3所示,在pH4.0～5.0的條件下,多酚得率差異性較小,在pH為5.5時,多酚得率達(dá)到最大值;當(dāng)pH超過5.5時,多酚得率顯著下降,且在pH6.0和pH6.5時,多酚得率無顯著性差異(p>0.05)。這可能與纖維素酶的最適酶解pH有關(guān),當(dāng)pH為5.5時,纖維素酶酶活力達(dá)到最大值,能夠充分水解植物纖維,破壞植物細(xì)胞壁,進(jìn)而充分釋放細(xì)胞內(nèi)的多酚物質(zhì);當(dāng)pH超過纖維素酶的最適pH范圍時,其酶活性大大降低,且過高的pH可能會改變底物的解離狀態(tài),從而影響酶與底物的充分結(jié)合,最終使多酚得率下降[14],因此選擇較佳的酶解pH為5.5。

圖3 酶解pH對多酚得率的影響Fig.3 Effect of the enzymolysis pH on the yield of polyphenols

2.1.4 酶解溫度對多酚得率的影響 由圖4可知,在酶解溫度為55 ℃時,多酚得率達(dá)到最大值,超過55 ℃后,多酚得率不再增加,其中70 ℃時多酚得率最小。適宜的高溫能夠促進(jìn)多酚物質(zhì)的充分溶解,但由于多酚物質(zhì)在高溫下不穩(wěn)定,易被氧化分解,因此,過高的溫度反而使多酚得率下降[18]。選擇55 ℃為較優(yōu)酶解溫度。

圖4 酶解溫度對多酚得率的影響Fig.4 Effect of the enzymolysis temperature on the yield of polyphenols

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取超聲時間、超聲功率、酶解pH、酶解溫度為實驗因素,進(jìn)行L9(34)正交試驗,并應(yīng)用SPSS 20.0對正交試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析。結(jié)果如表2、表3所示。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal design

表3 方差分析表Table 3 Results of variance Analysis

通過正交試驗結(jié)果(表2)直觀分析可知,影響赤霞珠葡萄皮渣中多酚得率的主次因素依次為A>D>B>C,即超聲時間>酶解溫度>超聲功率>酶解pH。通過方差分析(表3)可知,因素A差異顯著(p<0.05),即超聲時間對葡萄皮渣多酚得率具有顯著性影響。試驗確定超聲波輔助酶法提取赤霞珠葡萄皮渣中多酚的最佳工藝條件為A3B3C3D3,即超聲時間15 min,超聲功率400 W,酶解pH6.0,酶解溫度60 ℃。

2.3 工藝條件驗證

對正交試驗得到的最佳工藝條件進(jìn)行驗證實驗,在最佳工藝條件下,進(jìn)行三次重復(fù)實驗,得到赤霞珠葡萄皮渣中多酚的平均得率為1.493%±0.0068%,其結(jié)果高于正交試驗中任一組合的多酚得率,表明正交試驗確定組合為提取赤霞珠葡萄皮渣中多酚的最佳工藝參數(shù)。

3 結(jié)論

本實驗通過單因素實驗,并采用L9(34)正交試驗設(shè)計對赤霞珠葡萄皮渣多酚的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定最佳提取工藝參數(shù)為:超聲時間15 min,超聲功率400 W,酶解pH6.0,酶解溫度60 ℃,在此條件下多酚得率達(dá)1.493%±0.0068%。超聲波輔助酶法提取葡萄皮渣多酚具有工藝穩(wěn)定可行,環(huán)保節(jié)能且能夠保持葡萄皮渣中的有效活性成分等優(yōu)點,是提取葡萄皮渣多酚的有效途徑。