耿敬章

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

迷迭香屬于唇形科的芳香植物，具有豐富的使用價(jià)值[1,2]，在我國(guó)云南、貴州、廣西、海南等地有種植。迷迭香是一種名貴的天然香料植物，在生長(zhǎng)季節(jié)會(huì)散發(fā)一種清香氣味[3,4]。迷迭香是西餐中經(jīng)常使用的香料，經(jīng)常使用在牛排、土豆等料理以及烤制品中。同時(shí)，迷迭香還被廣泛用于醫(yī)藥、油炸食品、食品保鮮等[5,6]。研究表明，這些功能主要與迷迭香化學(xué)成分中的酚類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)有關(guān)[7]。迷迭香提取物中除了有熊果酸、α-蒎烯等物質(zhì)外，還有鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酸、迷迭香酚等二萜酚類(lèi)物質(zhì)。其中，二萜酚類(lèi)物質(zhì)具有明顯的抗微生物活性，在抗菌、消炎方面發(fā)揮巨大作用[8]。李斯特菌存在于絕大多數(shù)食品中，肉類(lèi)、蛋類(lèi)、海產(chǎn)品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染源[9-11]。因此，本文研究迷迭香多酚提取工藝及其抑制李斯特菌活性，以期對(duì)迷迭香多酚資源進(jìn)行深層次挖掘和利用。

1 材料及方法

1.1 原料與試劑

迷迭香：購(gòu)于當(dāng)?shù)刂兴幉呐l(fā)市場(chǎng)；乙醇、沒(méi)食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉、石油醚等：中國(guó)醫(yī)藥(上海)化學(xué)試劑公司；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)：上海緣肽生物技術(shù)有限公司；單增李斯特菌種：省農(nóng)科院提供；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

電動(dòng)攪拌機(jī) 江西安亭儀器設(shè)備廠；HZX-JA100電子天平 北京新陽(yáng)儀器設(shè)備有限公司；DK-8D超級(jí)水浴鍋 華立設(shè)備公司；721G型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)真空泵 天津貝納儀器設(shè)備有限公司；超聲波發(fā)生儀 北京天輝化工設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空干燥箱 安徽高博科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 迷迭香多酚提取工藝流程

迷迭香干葉→篩選→鼓風(fēng)干燥→粉碎→篩分→乙醇→超聲波提取→濾渣再提取→合并濾液→萃取→濃縮→真空干燥→迷迭香多酚提取物[12]。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

總酚含量：Folin-Ciocalteu法測(cè)定總酚含量[13]。

提取率=(C×V/m)×100%。

式中：C為提取液總酚含量，mg/mL；V為體積，mL；m為原料質(zhì)量，g[14]。

1.3.3 迷迭香多酚抑制李斯特菌活性實(shí)驗(yàn)

TSB培養(yǎng)基接種單增李斯特菌，37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后離心，添加生理鹽水，獲得200 CFU/mL菌懸液備用。用移液器吸取迷迭香多酚菌懸液到TSA培養(yǎng)基，然后涂布均勻，再加1%吐溫80，稀釋為200，100，50，25，12.5，6.25 mg/mL 6個(gè)梯度。以1%吐溫80為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，測(cè)抑菌圈直徑，平行實(shí)驗(yàn)3次[15-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對(duì)提取迷迭香多酚的影響

設(shè)定提取迷迭香多酚其他各因素條件，選取6，10，14，18，22，26 6個(gè)水平的液料比提取迷迭香多酚，檢測(cè)迷迭香多酚。有效成分提取的過(guò)程實(shí)質(zhì)是一個(gè)傳質(zhì)過(guò)程，因此操作條件中的液料比對(duì)提取效果至關(guān)重要[18]。

圖1 液料比對(duì)提取迷迭香多酚的影響Fig.1 Effect of liquid-material ratio on the extraction of rosemary polyphenols

由圖1可知，液料比小于18時(shí)，提取率逐漸提高，這是因?yàn)槊缘愣喾硬粩鄰墓腆w原料向液體溶劑傳質(zhì)，溶劑的滲透和有效成分的溶解進(jìn)行較快。當(dāng)液料比為18時(shí)，迷迭香多酚提取效果較好，提取率達(dá)到最大。當(dāng)液料比大于18時(shí)，提取率反而降低，這可能是因?yàn)檩^高的液料比增加了傳質(zhì)推動(dòng)力，使得提取效果下降。同時(shí)使用大量的溶劑會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)后處理操作造成負(fù)擔(dān)。因此，綜合考慮，迷迭香多酚提取過(guò)程中，液料比為18較為適宜。

2.2 乙醇濃度對(duì)提取迷迭香多酚的影響

設(shè)定提取迷迭香多酚其他各因素條件，選取50%、55%、60%、65%、70%、75% 6個(gè)水平的乙醇濃度提取迷迭香多酚，檢測(cè)迷迭香多酚。乙醇作為一種極性較強(qiáng)的溶劑，能提取出極性強(qiáng)或極性較弱的有效物質(zhì)[19]。乙醇濃度的變化能影響提取物密度、黏度、介電常數(shù)等物理性質(zhì)，進(jìn)而影響提取率。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取迷迭香多酚的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction of rosemary polyphenols

由圖2可知，迷迭香多酚的提取率隨乙醇濃度的提高先增大后減小。當(dāng)乙醇濃度分別為50%、55%時(shí)，迷迭香多酚提取率逐漸提高，當(dāng)乙醇濃度提高到60%時(shí)，迷迭香多酚提取率達(dá)到最高，說(shuō)明乙醇對(duì)提取多酚效果較好。當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，迷迭香多酚提取率反而下降，這可能是由于其他一些弱極性成分溶出量增加，減緩了酚類(lèi)物質(zhì)向乙醇溶劑的擴(kuò)散。因此，迷迭香多酚提取過(guò)程中，乙醇濃度為60%較為適宜。

2.3 超聲波功率對(duì)提取迷迭香多酚的影響

設(shè)定提取迷迭香多酚其他各因素條件，選取200，250，300，350，400，450 W 6個(gè)水平的超聲波功率提取迷迭香多酚，檢測(cè)迷迭香多酚。超聲波輔助提取是天然產(chǎn)物中有效成分提取的一個(gè)好方法，它操作簡(jiǎn)單，節(jié)省能耗，提取效果有保證[20]。

圖3 超聲波功率對(duì)提取迷迭香多酚的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction of rosemary polyphenols

由圖3可知，隨著超聲波功率提高，迷迭香多酚提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲波功率為350 W時(shí)，迷迭香多酚提取率達(dá)到最高。這是由于隨著超聲功率提高，超聲波引起的“空化效應(yīng)”加強(qiáng)，迷迭香多酚滲透速率加快。但是，當(dāng)超聲波功率大于350 W時(shí)，高壓環(huán)境致使迷迭香多酚的結(jié)構(gòu)受損，且雜質(zhì)溶出嚴(yán)重，導(dǎo)致迷迭香多酚提取率降低。因此，迷迭香多酚提取過(guò)程中，超聲波功率為350 W較為適宜。

2.4 超聲波時(shí)間對(duì)提取迷迭香多酚的影響

設(shè)定提取迷迭香多酚其他各因素條件，選取10，20，30，40，50，60 min 6個(gè)水平的超聲波時(shí)間提取迷迭香多酚，檢測(cè)迷迭香多酚。

圖4 超聲波時(shí)間對(duì)提取迷迭香多酚的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction of rosemary polyphenols

由圖4可知，超聲時(shí)間低于40 min時(shí)，迷迭香多酚提取率逐漸上升，當(dāng)超聲波時(shí)間為40 min時(shí)，提取率最大，之后逐漸下降。這可能是因?yàn)槌曁崛￠_(kāi)始時(shí)，細(xì)胞破碎逐漸增加，因此迷迭香多酚含量不斷提高。當(dāng)超聲40 min后，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，迷迭香多酚已基本溶出且部分被損壞，所以提取率下降。因此，迷迭香多酚提取過(guò)程中，超聲波時(shí)間為40 min較為適宜。

2.5 迷迭香多酚提取工藝條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

表1 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件的因素和水平 Table 1 Factors and levels of optimizing the extraction conditions by response surface methodology

表2 迷迭香多酚提取條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of extraction conditions of rosemary polyphenols

續(xù) 表

由表1可知，迷迭香多酚提取條件中，液料比、乙醇濃度、超聲波功率、超聲波時(shí)間對(duì)結(jié)果影響顯著。以下為提取率二次回歸擬合方程：

提取率(%)=4.22—0.065A-0.10B+0.50C+0.080D-0.028AB-0.10AC-0.095AD-0.42BC+0.016BD+0.086CD-0.50A2-0.16B2-0.57C2-0.45D2。

式中：A是液料比，B是乙醇濃度，C是超聲波功率，D是超聲波時(shí)間。迷迭香多酚提取條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Analysis of experimental results of response surface methodology

注：若“Prob>F”<0.05，表示因素為顯著因素。

迷迭香多酚提取實(shí)驗(yàn)失擬項(xiàng)不顯著，P值為0.8867，模型極顯著，P值<0.0001，所以能對(duì)提取迷迭香多酚的條件進(jìn)行預(yù)測(cè)。得到迷迭香多酚提取的最佳條件為液料比15，乙醇濃度56%，超聲波功率376 W，超聲波時(shí)間38 min。

圖5 液料比和乙醇濃度的相互作用Fig.5 Interaction between liquid-material ratio and ethanol concentration

由圖5可知，液料比與乙醇濃度的相互作用對(duì)提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著液料比與乙醇濃度的增大，提取率先增后減，變化幅度不大。

圖6 液料比和超聲波功率的相互作用Fig.6 Interaction between liquid-material ratio and ultrasonic power

由圖6可知，液料比與超聲波功率的相互作用對(duì)提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著液料比與超聲波功率的提高，提取率先增后減，變化幅度較大。

圖7 液料比和超聲波時(shí)間的相互作用Fig.7 Interaction between liquid-material ratio and ultrasonic time

由圖7可知，液料比與超聲波時(shí)間相互作用對(duì)提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著液料比與超聲波時(shí)間的提高，提取率先增后減，變化幅度不大。

圖8 乙醇濃度和超聲波功率的相互作用Fig.8 Interaction between ethanol concentration and ultrasonic power

由圖8可知，乙醇濃度與超聲波功率的相互作用對(duì)提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著乙醇濃度與超聲波功率的提高，提取率先增后減，變化幅度較大。

圖9 乙醇濃度和超聲波時(shí)間的相互作用Fig.9 Interaction between ethanol concentration and ultrasonic time

由圖9可知，乙醇濃度與超聲波時(shí)間的相互作用對(duì)提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著乙醇濃度與超聲波時(shí)間的提高，提取率先增后減。

圖10 超聲波功率和超聲波時(shí)間的相互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic power and ultrasonic time

由圖10可知，超聲波功率與超聲波時(shí)間的相互作用對(duì)提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著超聲波功率與超聲波時(shí)間的提高，提取率先增后減。

2.6 驗(yàn)證

設(shè)計(jì)表4來(lái)驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取迷迭香多酚的最佳條件的可靠性。

表4 結(jié)果驗(yàn)證Table 4 Verification of results

由表4可知，實(shí)驗(yàn)4的提取率最高，因此提取迷迭香多酚的最佳條件是液料比15，乙醇濃度56%，超聲波功率376 W，超聲波時(shí)間38 min。

2.7 迷迭香多酚抑制李斯特菌活性結(jié)果

圖11 迷迭香多酚抑制李斯特菌活性結(jié)果Fig.11 Results of antibacterial activity of Listeria monocytogene by rosemary polyphenols

由圖11可知，迷迭香多酚提取物是抑制李斯特菌的有效物質(zhì)，且抑菌程度有所不同[21-23]。隨著迷迭香多酚提取物濃度逐漸提高，抑菌圈直徑逐漸增大，當(dāng)濃度為200 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大。這可能是因?yàn)槊缘愣喾訐p傷李斯特菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，又或者是影響了李斯特菌的呼吸能量代謝，甚至影響了李斯特菌的DNA，進(jìn)而抑制了李斯特菌的活性[24，25]。

3 結(jié)論

響應(yīng)面優(yōu)化提取迷迭香多酚的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛯?shí)際情況擬合度比較好，結(jié)果可用，迷迭香多酚提取的二次回歸擬合方程如下：提取率(%)=4.22—0.065A-0.10B+0.50C+0.080D-0.028AB-0.10AC-0.095AD-0.42BC+0.016BD+0.086CD-0.50A2-0.16B2-0.57C2-0.45D2(式中：A是液料比，B是乙醇濃度，C是超聲波功率，D是超聲波時(shí)間)。迷迭香多酚提取的最佳條件是液料比15，乙醇濃度56%，超聲波功率376 W，超聲波時(shí)間38 min。

迷迭香多酚能在一定程度上抑制李斯特菌的活性，且隨著迷迭香多酚的濃度提高，抑制程度增大。