黃秋婷，王成龍，王宇,2，戚平，宋安華*

(1.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣州 510410；2.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山 528437)

醬油是中國(guó)家庭必不可少的調(diào)味料，在日常烹飪中需求量大。但在其生產(chǎn)工藝，豆制品發(fā)酵過(guò)程中，尿素或瓜氨酸會(huì)與乙醇反應(yīng)，產(chǎn)生一種2A類(lèi)致癌性化學(xué)污染物氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)[1]。醬油是發(fā)酵食品中EC的主要來(lái)源之一，陽(yáng)性率和污染水平均位于前列，甚至高于酒精飲料，存在較高的食品安全風(fēng)險(xiǎn)[2,3]。

目前檢測(cè)發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯常用的方法有高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等[4-6]。發(fā)酵食品的基質(zhì)較飲料酒更為復(fù)雜，液相色譜法存在較強(qiáng)的雜質(zhì)干擾，易出現(xiàn)假陽(yáng)性；采用LC-MS法或GC-MS法時(shí)，因EC分子量小，碎片特征性不足，導(dǎo)致背景噪音大，方法特異性較差。

本文針對(duì)醬油類(lèi)樣品的特點(diǎn)，采用優(yōu)化的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)[7]前處理方案，建立了四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定醬油中EC的方法。在測(cè)定中，考察了該檢測(cè)方法應(yīng)用于不同類(lèi)型醬油產(chǎn)品中的基質(zhì)效應(yīng)，探討了氨基甲酸乙酯的分子裂解規(guī)律，為研究降低醬油中氨基甲酸乙酯測(cè)定的基質(zhì)效應(yīng)提供了理論分析參考。

1 材料與方法

1.1 儀器及設(shè)備

UPLC-Q-Exactive超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；Multi Reax渦旋振蕩器 德國(guó)Heidolph公司；Synergy超純水系統(tǒng) 法國(guó)Millipore公司；MS 3 Digital渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；2600TH超聲波清洗器、0.22 μm水相濾膜 上海安譜儀器公司；AllegraX-30R高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；Poroshell 120 EC-C18色譜柱 美國(guó)Agilent公司。

1.2 試劑與樣品

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；冰乙酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；QuEChERS商用凈化管：含N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、石墨化炭黑(GCB)、無(wú)水硫酸鎂(MgSO4)：美國(guó)Agilent公司；氨基甲酸乙酯(EC，純度99%)：美國(guó)Aladdin工業(yè)公司；氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)(EC-D5，純度99.6%)：天津阿爾塔有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水；醬油樣品：均購(gòu)自廣州市內(nèi)超市。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取EC和EC-D5標(biāo)準(zhǔn)品約10.0 mg，分別用乙腈溶解，然后轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中定容，分別配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于4 ℃。根據(jù)試驗(yàn)情況，使用超純水逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的工作液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取約5.00 g樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)EC-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液，再加入10 mL乙腈，于渦旋振蕩器上混勻提取10 min后，在6000 r/min的條件下冷凍離心3 min，待凈化。

1.3.3 凈化

取上層有機(jī)液5 mL，置于15 mL QuEChERS基質(zhì)分散固相萃取凈化管 (含400 mg PSA、400 mg C18、45 mg GCB以及1200 mg MgSO4)中，于渦旋振蕩器上混勻，在6000 r/min的條件下離心3 min，取凈化后的上清液1 mL，加水定容至5 mL，過(guò)0.22 μm水相濾膜，濾液待UPLC-MS進(jìn)樣分析。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 色譜分析條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%乙酸水(V/V)，B為乙腈，等度洗脫(95%+5%，體積比)；進(jìn)樣量：5 μL；進(jìn)樣器溫控：20 ℃；流速：0.25 mL/min；柱溫：20 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度：350 ℃；接口溫度：320 ℃；噴霧電壓：3000 V(正離子模式)；一級(jí)質(zhì)譜全掃描分辨率：70000；掃描范圍：m/z 50～750； C-trap最大注入時(shí)間：50 ms；C-trap最大容量(AGC target)：1×106； PRM二級(jí)子離子全掃描分辨率：17500；二級(jí)C-trap最大容量：2×105；二級(jí)C-trap注入時(shí)間：100 ms；階越式碰撞能(stepped NCE)：(25±15)%；定性離子對(duì)和定量離子對(duì)等質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 EC和EC-D5的分子式及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Molecular formulas and mass parameters of ethyl carbamate(EC)and EC-D5

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 萃取溶劑選擇

實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為萃取試劑。EC水溶性好，乙腈對(duì)此類(lèi)極性強(qiáng)的小分子化合物有較好的溶解性。此外，乙腈能對(duì)醬油基質(zhì)有較好滲透，同時(shí)保證了提取較少親脂性干擾物。醬油類(lèi)樣品含有大量的食鹽，經(jīng)鹽析，乙腈層會(huì)與水相分層，該萃取過(guò)程有助于乙腈層保留較少的糖類(lèi)與色素類(lèi)雜質(zhì)。

2.1.2 QuEChERS凈化方法優(yōu)化

目前QuEChERS凈化方法使用的吸附劑主要是PSA、GCB、C18這3種物質(zhì)，根據(jù)不同樣品基質(zhì)特點(diǎn)來(lái)單獨(dú)或組合使用，以達(dá)到凈化的目的。有研究人員利用Box-Behnken Design建模法[8]、Full Factorial Design全篩法等[9]實(shí)驗(yàn)優(yōu)化吸附劑的組合，使凈化效果最佳，并最終確立推廣了一系列商業(yè)化的QuEChERS凈化包，能針對(duì)各果蔬基質(zhì)的主要干擾物進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的凈化。但醬油的成分相對(duì)于果蔬更為復(fù)雜，除含食鹽外，還有多種氨基酸、糖類(lèi)、有機(jī)酸、色素及香料等成分。老抽醬油還添加了焦糖，其樣品顏色濃、粘稠度大，增加了樣品凈化難度。

因此，基于實(shí)驗(yàn)成本、效率考量，以老抽為樣品基質(zhì)，選擇目前流通的各商業(yè)化QuEChERS凈化方案(吸附劑凈化方案A：填料含400 mg PSA、400 mg GCB、1200 mg MgSO4；方案B：含150 mg PSA、900 mg MgSO4；方案C：含400 mg PSA、400 mg C18、45 mg GCB、1200 mg MgSO4；方案D：含50 mg PSA、150 mg C18、900 mg MgSO4)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。通過(guò)比較采用不同凈化方法下EC加標(biāo)的絕對(duì)回收率(加標(biāo)濃度為5 μg/kg，外標(biāo)法定量)、除色效果、凈化液與空白處理液的EC-D5峰面積比值(因EC在樣品中存在本底，故采用EC-D5)，綜合得出醬油測(cè)定的最佳凈化方法。

表2 不同凈化方法下EC的加標(biāo)回收率 與EC-D5峰面積比值Table 2 Spike recoveries of EC and peak area comparisons of EC-D5 by various purification methods

圖1 不同凈化方案的除色效果比較Fig.1 Comparison of color removal effect by various purification methods

由表2和圖1可知，凈化方案C除色效果最佳，且凈化后的目標(biāo)物峰響應(yīng)有顯著增強(qiáng)，同時(shí)也能滿(mǎn)足EC的加標(biāo)回收要求。因此，QuEChERS凈化方案C可應(yīng)用于醬油基質(zhì)EC的測(cè)定。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除了目標(biāo)分析物以外的其他成分對(duì)待測(cè)物濃度的影響，即基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確性的干擾[10]。高分辨質(zhì)譜具有高分辨率和高靈敏性的特點(diǎn)，易受共流出物干擾及離子化效率的影響，在定量分析時(shí)需充分考慮樣品基質(zhì)效應(yīng)。EC在醬油樣品中存在本底值，因此使用EC的內(nèi)標(biāo)化合物EC-D5開(kāi)展醬油基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

以空白樣品配制濃度為20 ng/mL的EC-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液。取市售常見(jiàn)的醬油品種(燒烤汁、老抽、壽司醬油、生抽)，按照1.3.2和1.3.3方法提取凈化，再用凈化后的各樣品處理液分別配制相同濃度的EC-D5基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種醬油做6個(gè)基質(zhì)平行。檢測(cè)方法的基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect)以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的EC-D5峰面積的比值來(lái)表示，即ME=(基質(zhì)中分析物的峰面積÷純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e-1)×100[11]。評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)時(shí)，6個(gè)基質(zhì)平行結(jié)果舍去最大值和最小值后，計(jì)算平均值。若ME>0，則表示該基質(zhì)對(duì)EC存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，反之若ME<0，則表示該基質(zhì)對(duì)EC存在基質(zhì)抑制現(xiàn)象。不同醬油基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)圖2。

圖2 醬油中EC測(cè)定的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effect of EC detection in soy sauce

由圖2可知，各醬油|ME|≤20%，其數(shù)值在誤差區(qū)間浮動(dòng)之內(nèi)，實(shí)驗(yàn)方法對(duì)各醬油基質(zhì)均無(wú)基質(zhì)效應(yīng)[12]。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化

氨基甲酸乙酯為一種有機(jī)堿，流動(dòng)相呈酸性時(shí)，能提升離子化效率且使峰形對(duì)稱(chēng)，因此流動(dòng)相水相選取了0.1%乙酸水；此外，EC極性較強(qiáng)，一般的反相柱難以保留，該方法采用全多孔硅膠核殼柱Poroshell 120 EC-C18，柱溫設(shè)為20 ℃，流動(dòng)相以柱子可耐受的較高比例水相：乙酸水-乙腈(95%+5%)等度洗脫[13]。EC和EC-D5色譜保留較好，峰形對(duì)稱(chēng)，見(jiàn)圖3。

圖3 EC和EC-D5平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM)色譜圖Fig.3 Parallel reaction monitoring (PRM) of EC and EC-D5

EC這類(lèi)小分子化合物，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，能形成較穩(wěn)定的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+(m/z 90.06496)。為在定量上能有較好的重現(xiàn)性，選擇平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(PRM)進(jìn)行測(cè)定：四級(jí)桿過(guò)濾后，階躍式碰撞能(NCE)碎裂并疊加，高分辨的二級(jí)子離子完成專(zhuān)屬定量。對(duì)于較明顯的二級(jí)碎片離子進(jìn)行分子擬合，同位素模擬，并篩選特征碎片，根據(jù)精確分子量的質(zhì)量差推斷出該小分子的裂解方式[14]，見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 測(cè)定的同位素分布(a)與EC的特征碎片 離子元素組成分析(b)Fig.4 Determination of isotope distribution (a) and element composition analysis of fragment ions of EC (b)

圖5 EC的MS2裂解模式Fig.5 MS2 fragmentation pattern of EC

注：rHB表示電荷中心引發(fā)的重排(α，β)；rHC表示電荷中心引發(fā)的重排(γ)。

[CH4O2N]+(m/z 62.02378)作為特征離子，是EC化合物的定性和定量離子，在高分辨質(zhì)譜中能找到該離子A1同位素峰，符合圖5中MS2的裂解規(guī)律。

2.4 線(xiàn)性參數(shù)及檢出限、定量限

取EC及EC-D5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加超純水，配制成EC-D5的質(zhì)量濃度均為20 μg/L，EC質(zhì)量濃度分別為1，2，5，10，20 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。按1.3和1.4所述方法條件進(jìn)行測(cè)定，獲得峰面積，采用最小二乘法進(jìn)行回歸分析，其中x為EC質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)EC-D5質(zhì)量濃度的比值，y為EC峰面積與內(nèi)標(biāo)EC-D5峰面積的比值，得到在1～20 μg/L范圍內(nèi)EC的線(xiàn)性回歸方程y=-0.00573311+0.0425925x，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9997，線(xiàn)性關(guān)系良好。檢出限(LOD，S/N=3)為0.5 μg/kg，定量限(LOQ，S/N=10)為1.5 μg/kg。

2.5 方法回收率及精密度

取不同基質(zhì)類(lèi)型的醬油樣品，分別進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，EC加標(biāo)水平分別為5，50 μg/kg，內(nèi)標(biāo)化合物EC-D5的加標(biāo)水平為20 μg/kg，每個(gè)濃度做6次平行，內(nèi)標(biāo)法定量，方法回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同基質(zhì)類(lèi)型的各醬油加標(biāo)回收率 和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of EC in different matrix types of soy sauce (n=6)

由表3可知，在不同加標(biāo)水平下，各樣品加標(biāo)回收率在89.4%～108.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%～6.4%，可見(jiàn)該方法有著良好的精密度和準(zhǔn)確度，符合實(shí)際檢測(cè)分析要求。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本研究建立的檢測(cè)方法對(duì)市場(chǎng)流通度較高的9種品牌醬油進(jìn)行了測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 市售醬油中EC的檢測(cè)結(jié)果(n=6)Table 4 The determination results of EC in soy sauce (n=6)

由表4可知，醬油樣品中EC的檢出率較高，范圍在11.98～41.70 μg/kg。

3 結(jié)論

本研究建立的四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)醬油類(lèi)調(diào)味品中氨基甲酸乙酯的方法具有較好的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。Q-Exactive平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(PRM)可以篩取EC母離子和特征碎片的精確質(zhì)量數(shù)，通過(guò)比對(duì)二級(jí)碎片的同位素分布初步推導(dǎo)出化合物的質(zhì)譜裂解模式，PRM模式針對(duì)小分子能具有較高的定性、定量水平。將優(yōu)化了凈化方案的QuEChERS方法應(yīng)用于醬油的前處理，使方法快速、高效、環(huán)境友好，且無(wú)基質(zhì)效應(yīng)，能滿(mǎn)足于日常監(jiān)督中的快速篩查和方法確證，為調(diào)味品的質(zhì)量安全監(jiān)管提供了檢測(cè)方法保障。