王紅梅 蔡興偉 徐 邁 何 鑫 郝作琦

口腔是人體消化道的入口，既有消化功能，又存在大量微生物，因此口腔健康對人體健康起著至關(guān)重要的作用，而口腔維護是清潔口腔、預(yù)防口腔及全身疾病的重要手段[1]。牙周病是局部慢性感染性口腔疾病，以厭氧菌感染為主，牙周袋內(nèi)的細菌、微生物及其產(chǎn)物擴散至附近或遠隔器官，從而導(dǎo)致慢性炎癥狀態(tài)，造成牙周組織破壞[2,3]，老年人由于身體機能退化，這一過程更為迅速。在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中，MMPs中的MMP-3可以剪切、活化其它類型MMPs，并引起牙槽骨吸收和改建[4,5]。有研究顯示丹皮酚(Paeonol，Pae)具有鎮(zhèn)靜、解熱、抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化等藥理特性[6,7]，推測丹皮酚對牙周組織同樣具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的功效。因此，根據(jù)老年人的生理、心理和社會特點，本研究通過觀察使用丹皮酚水提取物對老年人進行口腔維護前后GCF總量、GCF中MMP-3水平的變化以及5種牙周致病菌的檢出率，探討丹皮酚對老年人牙周組織炎癥的影響，為選擇簡便合理的臨床口腔維護方式提供參考。

1.材料與方法

1.1 病例納入及分組 選擇2015年6月～2017年6月在火箭軍特色醫(yī)療中心口腔科進行口腔常規(guī)體檢的老年患者(≥60歲)120例，男性68例，女性52例，年齡(60.2±4.5)歲，以隨機數(shù)法平均分為A、B、C三組：A組患者使用丹皮酚水提取物(500mmol/L含漱，不低于1min)漱口；B組患者使用醫(yī)用棉簽蘸取雙氧水(3%)擦拭牙齦組織，每象限擦拭時間1min；C組患者使用生理鹽水含漱1min。各組患者每天按分組狀況維護6次并進行常規(guī)口腔維護(早中晚三次刷牙，Bass刷牙法)。納入條件：無未充填的齲壞，無中、重度慢性成人牙周炎且無全身系統(tǒng)性疾病，口內(nèi)余留牙不少于20顆，口內(nèi)檢測AL＜3mm[8]；研究開始一周前進行牙周潔治；3個月內(nèi)未使用抗生素以及免疫抑制劑。三組患者一般資料(年齡、性別、職業(yè)、婚姻、學(xué)歷、基礎(chǔ)疾病史等)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。所有患者均知情同意。

1.2 材料 標準菌株(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔內(nèi)科學(xué)實驗室，中國)；丹皮酚(中國藥品生物制品檢定所，中國)，酶聯(lián)檢測儀(南京華東電子，中國)；ELISA試劑盒(廣州欣盛生物工程有限公司，中國)；Whatman專用濾紙(Whatman公司，英國)。

1.3 口腔檢查 受試者的口腔檢測由同一位高級職稱醫(yī)師完成。使用Williams牙周探針檢測全口余留牙齒6個位點(頰面近中，中部，遠中；舌面近中，中部，遠中)。記錄探診深度(probing depth，PD)以及附著喪失程度(attachment loss，AL)，取平均值并且記錄菌斑指數(shù)(plaque index，PLI)以及缺牙數(shù)及牙齒松動度。

1.4 采集樣本 將Whatman濾紙裁成8mm×3mm大小，消毒、烘干并稱重。吹干檢測區(qū)域、隔濕，將濾紙插入待測患牙頰側(cè)中部齦溝內(nèi)，1min后取出并再次稱重，復(fù)檢三次取平均值，前后質(zhì)量差為GCF量。濾紙使用2%PBS液離心(10000r/min，10min)后提取上清液，于低溫冰箱-70℃保存待檢?；颊呙恐苓M行電話隨訪，并于1個月和3個月后復(fù)查，采集齦溝液樣本。

1.5 測定MMP-3含量 解凍樣本，稀釋后加入生物素標記的抗體，振蕩混勻37℃溫育1h，洗滌后吸干并重復(fù)3次；加入親和鏈酶素-HRP混勻，37℃溫育30分鐘后吸干，重復(fù)3次加入底物振蕩混勻，37℃溫育10min，加入終止液并立即測定MMP-3含量(MMP含量=MMP總量/GCF量；MMP總量=MMP檢測量×洗脫體積)。

1.6 牙周致病菌的檢測 維護前后，分別將各組患者檢測區(qū)域吹干并用無菌棉球嚴格隔濕后，去除齦上菌斑和牙結(jié)石，采用4-site法(患者口內(nèi)按象限分為四個區(qū)，每個區(qū)牙周探診最深點作為取樣點)使用無菌刮匙刮取齦袋底的齦下菌斑，在待測牙頰側(cè)中部取樣點插入標準滅菌紙尖至牙周袋底，靜置10s后取出紙尖裝入含有厭氧轉(zhuǎn)送液的離心管，加入2%PBS液高速離心(12000r/min，10min)后提取沉淀DNA。自行設(shè)計、合成引物(表1)，對齦下菌斑DNA進行擴增，以5種標準菌株：伴放線放線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,A.a)(ATCC 29523)、牙齦卟啉單孢菌(Porphyromonas gingivdis,P.g)(ATCC33277)、中間普氏菌(Prevotella intermedia,P.i)(ATCC 25611)、福賽氏類桿菌(Tannerella forsythia,T.f)(ATCC 43037)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola,T.d)(ATCC 43037)為陽性對照，以變異鏈球菌(ATCC 27607)為陰性對照。

表1 5種牙周致病菌特異性引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，本實驗為測量時間間隔不等重復(fù)資料，采用不等距重復(fù)測量的方差設(shè)計，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

最終完成維護的患者共120人，使用重復(fù)測量資料的方差分析，組間和組內(nèi)比較分別使用LSD檢驗和Bonferroni檢驗。

2.1 牙周指標比較 組內(nèi)比較時，A、B兩組維護后PD、PLI指數(shù)在1個月、3個月與維護前相比均有顯著性差異(P＜0.05)；AL指數(shù)僅在3個月時與維護前相比均有顯著性差異(P＜0.05)；C組維護前后相比無顯著性差異(P＞0.05)。組間比較時，A、B兩組PD、PLI指數(shù)與C組在維護后的不同時間點均有顯著性差異(P＜0.05)；而僅在3個月時A、B兩組AL指數(shù)與C組比較有顯著性差異(P＜ 0.05)(表 2～表 4)。

2.2 GCF量、MMP-3含量比較、組內(nèi)比較時，A、B兩組維護后GCF量、MMP-3水平在1、3個月與維護前相比均有顯著性差異(P＜0.05)，C組維護前后相比無顯著性差異(P＞0.05)。組間比較時，A、B兩組與C組在維護后的不同時間點均有顯著性差異(P＜0.05)，而僅在3個月時A、B兩組GCF量、MMP-3水平比較有顯著性差異(P＜ 0.05)(表 5，表 6)。

2.3 5種牙周致病菌的檢出情況比較 A、B組致病菌的檢出率與維護前比較具有顯著性差異(P＜0.05)，C組牙齦卟啉單孢菌、中間普氏菌和福賽氏類桿菌與維護前比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，齒垢密螺旋體和伴放線放線桿菌的檢出率與維護前比較具有顯著性差異(P＜0.05)；B組和C組牙周致病菌檢出率高于A組(P＜0.05)；C組牙周致病菌檢出率高于B組(P＜0.05)(表7)。

表2 牙周指數(shù)PD維護前、后的分組比較(x±s)

表3 牙周指數(shù)AL維維護前、后的分組比較(x±s)

表4 牙周指數(shù)PLI維護前、后的分組比較(x±s)

表5 GCF量維護前、后的分組比較(x±s)

表6 MMP-3含量維護前、后的分組比較(x±s)

表7 5種牙周致病菌的檢出情況比較(N/%)

3.討論

大部分老年患者缺乏口腔維護健康知識，進行口腔維護時，應(yīng)該從患者生理、心理、社會的特點出發(fā)，做好不同年齡、職業(yè)以及經(jīng)濟收入的人群的口腔維護教育工作，耐心聽取患者的意見，緩解患者的緊張情緒，使其接受維護和治療[9]。在維護前，要了解老年患者口腔大體情況，并且在與患者積極溝通的情況下，征得本人同意進行維護和治療，維護過程中需要加強與患者的交流與溝通，患者的配合對于治療和維護有著非常重要的意義。

丹皮酚(C9H10O3)是芍藥科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的根皮中主要的藥物活性成分，具有抗動脈粥樣硬化、抗心律失常、促進微循環(huán)、保護缺血組織、抗腫瘤、抗菌等多種藥理作用[10]。目前尚無Pae對牙周組織炎癥的報道。GCF是牙齦組織分泌的一種體液，主要來源于齦溝上皮和結(jié)締組織的破壞產(chǎn)物；牙周組織產(chǎn)生的間質(zhì)液；血漿以及齦下微生物的產(chǎn)物，可以用來反映牙周組織的健康情況。MMP-3是一種含有二價鋅離子酶活性中心的蛋白水解酶的基質(zhì)溶解素，MMP-3可以剪切、活化并誘導(dǎo)其它類型MMPs表達[11]，以引起牙槽骨的吸收和改建。MMP-3還可以降解細胞外基質(zhì)，在組織破壞與重建中起重要作用[12]。MMP-3主要由破骨細胞、破牙骨質(zhì)細胞以及牙周膜成纖維細胞分泌，可以反映牙周炎癥的程度[13]。因此，MMP-3水平可作為反映牙周組織的破壞和炎癥水平，是評價牙周組織臨床及維護療效的客觀指標之一。

本實驗結(jié)果顯示A、B兩組維護后牙周指數(shù)出現(xiàn)不同程度的下降，GCF量、MMP-3水平有顯著性下降(P＜0.05)，C組無明顯差異(P＞0.05)。維護后的同一時間點A、B兩組與C組有顯著性差異(P＜0.05)，而在3個月時A、B兩組GCF量、MMP-3水平比較有顯著性差異(P＜0.05)。說明丹皮酚漱口和雙氧水擦拭的維護方式可以減少牙周組織進一步損傷，使炎性細胞因子分泌下降，并改變中性粒細胞的趨化功能，使炎癥介質(zhì)分泌減少，牙周組織炎癥得以恢復(fù)。相同的環(huán)境下丹皮酚漱口比雙氧水擦拭的維護方式要更優(yōu)越，這可能是因為丹皮酚更強力的抗炎和調(diào)節(jié)免疫效果，具體機制需要通過進一步實驗來驗證。

牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中細菌感染是始動因素。本研究選取5種公認的牙周可疑致病菌，其中P.g是重要的牙周致病菌之一，牙周炎癥越重，齦下菌斑中P.g的檢出率越高，P.g、T.f和T.d三者又稱“紅色復(fù)合體”，具有顯著的毒力和致病性，能干擾宿主的防御機制以破壞牙周組織。本研究采用PCR法進行厭氧菌檢測。結(jié)果表明丹皮酚與雙氧水都有一定的抑菌作用(P＜0.05)，而生理鹽水不具備這樣的作用(P＞0.05)，丹皮酚與雙氧水比較時顯示丹皮酚可以顯著降低老年人牙周可疑致病菌的檢出率(P＜0.05)。

本研究通過觀察三種不同的口腔維護方式對老年人GCF、MMP-3水平變化的影響以及牙周致病菌的檢出率，說明丹皮酚漱口和雙氧水擦拭的維護方式比生理鹽水漱口的維護方式預(yù)后效果更好，而丹皮酚漱口的維護方式效果更為優(yōu)越，為臨床牙周炎的維護選擇提供理論實驗依據(jù)。同時3種維護方式對于牙周指數(shù)指標、GCF以及MMP-3水平的長期影響以及對于口腔正常菌群的影響還需要進一步跟蹤研究。