梁 婕 曾敏敏 鄭晨韻 陳深元 陳錫姣 楊雪瓊 龔道元 陳 鑫

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)藥工程學(xué)院，廣東省佛山市 528000

齲病和牙周病是人類常見的口腔疾病之一，齲病和牙周病發(fā)生的始動(dòng)因子是牙菌斑。牙菌斑是附著于牙面、牙間或修復(fù)體表面的細(xì)菌性生物膜，容納了各種需氧菌、厭氧菌。人類牙菌斑中厭氧鏈球菌占大多數(shù)，其中變異鏈球菌、唾液鏈球菌、輕型鏈球菌和血鏈球菌在牙菌斑厭氧鏈球菌中占比較大，而變異鏈球菌更是致齲優(yōu)勢(shì)菌。因此抑制牙菌斑主要組成鏈球菌有機(jī)會(huì)抑制牙菌斑的形成，從而有效預(yù)防齲病和牙周病[1]。

升麻作為一種傳統(tǒng)中藥，在臨床上常常被用于預(yù)防及治療口腔疾病，通過查閱有關(guān)的中醫(yī)古文記錄，也發(fā)現(xiàn)古人在治療口腔疾病過程中也使用了升麻這種中藥。升麻具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛解毒作用，其成分含具有抗菌作用的乙酯[2]。中藥在我國(guó)來源豐富，副作用較小，尋找安全有效的防齲藥物是學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)中藥對(duì)口腔致病菌的研究很多，研究對(duì)象大部分主要為有明確抗菌作用的中藥[3-4]，而升麻作為一種可治療口腔疾病的傳統(tǒng)中藥，其對(duì)口腔致病菌作用的研究十分有限。根據(jù)有關(guān)升麻對(duì)口腔致病菌的最新研究進(jìn)展，可確認(rèn)升麻輔助五倍子等中藥的使用可對(duì)變異鏈球菌等有抑制作用。

因此本課題將研究升麻對(duì)4種牙菌斑主要組成鏈球菌的體外抑制活性，以期望可進(jìn)一步的研究升麻是否具有抑制牙菌斑形成的活性，從而有效的預(yù)防齲病或牙周病。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、培養(yǎng)基及藥物:變異鏈球菌(Streptococcusmutans)ATCC25175、血鏈球菌(Streptococcussanguinis)ATCC49295、唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)ATCC7073及乙型溶血鏈球菌(β-Hemolyticstreptococcus)CMCC32210均購(gòu)于北納生物，BHI液體培養(yǎng)基購(gòu)于；升麻購(gòu)于佛山市北京同仁堂。

1.1.2 試劑及儀器：75%乙醇、厭氧袋、96孔板、恒溫培養(yǎng)箱、回流儀器、粉碎機(jī)、移液槍。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備：升麻于2017年11月于佛山北京同仁堂購(gòu)入。將100g升麻粉碎，用藥重量6～14倍量體積的75%乙醇回流提取3次，每次回流2h，合并提取液，減壓濃縮成150ml的提取液[3]。取6管1ml的升麻提取液干燥后可得6管提取物，重量如表1。通過表1的數(shù)據(jù)計(jì)算可知升麻提取液的濃度約為13.5mg/ml,將提取液稀釋到10mg/ml作為抑菌試驗(yàn)的母液。

表1 升麻提取液干燥后提取物重量

1.2.2 菌懸液的配制：將各菌株復(fù)蘇48h后，分別接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取細(xì)菌接種于BHI液體培養(yǎng)基配成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木?1.5×108/ml)，用BHI液體培養(yǎng)基稀釋1 000倍成試驗(yàn)用的菌懸液。

1.2.3 最小抑菌濃度的測(cè)定：采用微量肉湯稀釋法。取96孔板在每一排最左側(cè)標(biāo)記4種鏈球菌的名稱，以一排為例，將從左往右數(shù)第11孔用作“BHI液體培養(yǎng)基+菌陽(yáng)性對(duì)照”，標(biāo)記為“+”，第12孔標(biāo)記為“BHI液體培養(yǎng)基陰性對(duì)照”，標(biāo)記為“-”。在第1孔加入升麻提取液(10mg/ml)200μl，在第2～12孔每孔均加入BHI液體培養(yǎng)基100μl。使用移液槍從第1孔中取100μl提取液至第2孔，混勻，依次進(jìn)行到第10孔，棄去100μl混合液，達(dá)到倍比稀釋藥物提取液的目的，使1～10孔的藥物濃度分別為5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.312mg/ml、0.156mg/ml、0.078mg/ml、0.039mg/ml、0.019 5mg/ml、0.001mg/ml。諸如此類，4種細(xì)菌使用4排孔進(jìn)行試驗(yàn)。每排的第1～11孔加入與各排標(biāo)記的細(xì)菌名稱所對(duì)應(yīng)的菌懸液100μl，最后將該96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，重復(fù)試驗(yàn)3次，觀察現(xiàn)象，以肉眼所見微孔內(nèi)能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為該抗菌藥物對(duì)受試菌的MIC。

2 結(jié)果

升麻提取液對(duì)4種細(xì)菌的抑制活性。經(jīng)過3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得4種牙菌斑主要組成鏈球菌對(duì)升麻提取液中的MIC及其平均值見表2；可看出升麻提取液對(duì)牙菌斑的幾種主要組成鏈球菌都有抑菌作用，其中對(duì)變異鏈球菌和唾液鏈球菌的抑制作用最為明顯，MIC可以達(dá)到0.2mg/ml左右，明顯優(yōu)于對(duì)乙型溶血鏈球菌和血鏈球菌的作用，后兩者M(jìn)IC均>1mg/ml。

表2 升麻對(duì)牙菌斑4種主要組成鏈球菌的最小抑菌濃度MIC(mg/ml)

3 討論

牙菌斑生物膜是齲病和牙周病的始動(dòng)因子，而齲病和牙周病正是人類最普遍的兩種口腔疾病。本次研究的4種鏈球菌為牙菌斑生物膜種幾種常見鏈球菌，其中變異鏈球菌和血鏈球菌對(duì)維持牙菌斑的生態(tài)平衡有著非常重要的作用，變異鏈球菌通過產(chǎn)生胞外多糖粘附在光滑的牙面上，它的產(chǎn)酸性和耐酸性更使其成為重要的致齲菌[5]。乙型溶血性鏈球菌致病力強(qiáng)，常引起人類和動(dòng)物的多種疾病。因此，以這4種鏈球菌作為研究針對(duì)抑制牙菌斑形成或防齲藥物的實(shí)驗(yàn)菌種，具有實(shí)際意義。早期抗生素被用于預(yù)防或輔助治療齲病和牙周病，但長(zhǎng)期使用抗生素可引起口腔菌群生態(tài)平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致其他疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)，口腔細(xì)菌的耐藥性和細(xì)菌檢出率有逐年上升的趨勢(shì)[6]。故尋找毒副作用小的新藥物是非常必要的。非常多的中國(guó)傳統(tǒng)中草藥有清熱解毒、抑菌殺毒的作用，并且毒副作用小[7]。若能選出一種具有抑制這4種牙菌斑主要鏈球菌的中草藥，將可為延緩或抑制牙菌斑的形成提供一種重要方式。升麻具有清熱解毒、抗癌抗氧化的作用，升麻提取物具有較好的殺菌活性。升麻作為一種常用中草藥，自古以來便被用于治療口腔疾病。鄭雅楠[8]使用升麻提取物等制作了用于防治牙周病的口腔護(hù)理液。王記祥等[9]通過回流提取升麻根莖中的化合物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中25-O-乙酰升麻醇、興安升麻苷C和β-谷甾醇共3種化合物具有較好的抗菌活性。胡桂清、李建志等[4，7]發(fā)現(xiàn)升麻對(duì)金黃色葡萄球菌、埃希大腸桿菌等具有明顯抑菌作用。但有關(guān)升麻對(duì)口腔細(xì)菌的研究甚少，近幾年才開始開展研究，劉玉梅[10]發(fā)現(xiàn)五倍子和升麻配伍使用可抗齲病相關(guān)的口腔致病菌，胡小艷[11]發(fā)現(xiàn)升麻對(duì)牙齦卟啉單胞菌具有較強(qiáng)的抑制活性?？梢娚榫哂休^好的抑菌特性，并且對(duì)某些口腔致病菌具有良好的抑制活性。本研究以升麻提取液作為實(shí)驗(yàn)試劑，來對(duì)4種組成牙菌斑的鏈球菌的抑制活性，研究結(jié)果證實(shí)了升麻對(duì)變異鏈球菌和唾液鏈球菌有顯著的抑制作用，最小抑菌濃度可達(dá)0.21mg/ml；對(duì)血鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌有較好的抑菌濃度，最小抑菌濃度可達(dá)1.67mg/ml。升麻在我國(guó)應(yīng)用廣泛，具有毒副作用小、資源豐富、成本不高等優(yōu)點(diǎn)，本次研究結(jié)果表明升麻對(duì)4種牙菌斑主要組成的鏈球菌有良好的抑制活性，其作為防治齲病或牙周病的藥物具有巨大的開發(fā)潛力。但牙菌斑的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，齲病和牙周病也是多因素引起的疾病，僅僅研究藥物對(duì)某幾種特定的細(xì)菌的抑制活性并不能證明其具有作為藥物的價(jià)值。不同提取方法對(duì)升麻提取物的影響、長(zhǎng)期使用升麻對(duì)口腔菌群生態(tài)平衡的影響，抑制這4種鏈球菌是否對(duì)牙菌斑的形成具有抑制作用，這些問題都需要再進(jìn)一步的探索與研究。