朱穎 湯玉茗 黃佳 李為光 章永平 王建承 張學(xué)軍 姚瑋艷

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200025

本課題組既往研究結(jié)果顯示全反式維甲酸能誘導(dǎo)多株胰腺癌細(xì)胞凋亡[1]，通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡過程中腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis induced ligand, TRAIL)的受體(TRAIL-R)顯著升高，經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRAIL的表達(dá)隨全反式維甲酸誘導(dǎo)時(shí)間的延長而增高。本研究旨在通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TRAIL基因進(jìn)一步探索TRAIL對(duì)胰腺癌細(xì)胞的促凋亡機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞株及質(zhì)粒的制備、鑒定及轉(zhuǎn)染

3株人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PaTu8988和BxPC3，攜帶TRAIL基因的真核表達(dá)載體pCA13(pCA13-TRAIL)、空質(zhì)粒(pCA13)和帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的pCA13-EGFP質(zhì)粒由中科院上海生命科學(xué)研究院生化細(xì)胞所提供。制備感受態(tài)大腸桿菌，分別加入pCA13-TRAIL、pCA13或pCA13-EGFP混勻，處理后涂布于LB平板上常規(guī)培養(yǎng)10 h，挑取單個(gè)克隆接種于培養(yǎng)基中，獲取細(xì)菌，常規(guī)抽提質(zhì)粒。

通過BglⅡ酶切和SalⅠ、HidⅢ雙酶切及PCR鑒定TRAIL質(zhì)粒是否制備成功。采用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株(pCA13-TRAIL組)，以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為對(duì)照組(pCA13組)。以轉(zhuǎn)染pCA13-EGFP的細(xì)胞在高倍視野下計(jì)算質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率，即質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率=帶綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

二、TRAIL mRNA和蛋白表達(dá)檢測

分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h收取細(xì)胞，抽提總RNA及制備蛋白勻漿。采用RT-PCR方法檢測TRAIL(860bp)mRNA表達(dá)。引物正義序列為5′-ATGGCTATGATGGAGGTCCAG-3′，反義序列為5′-ACTGGCTTCATGGTCCATGTC-3′；內(nèi)參β-actin引物正義序列為5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′；反義序列為5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′。引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

蛋白定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測TRAIL蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。鼠抗人TRAIL單抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，1∶100稀釋；鼠抗人β-actin抗體購自美國Sigma公司，1∶4 000稀釋。羊抗鼠二抗1∶4 000稀釋。最后ECL發(fā)光，X片曝光顯影后用凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描條帶灰度值，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白表達(dá)量。

三、細(xì)胞凋亡的形態(tài)觀察及凋亡率檢測

細(xì)胞用2.5%戊二醛4℃固定1 h以上。常規(guī)包埋、超薄切片，通過透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。收集各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，離心后棄上清液，重懸細(xì)胞，密度調(diào)整為2×105個(gè)/ml。采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率。TUNEL試劑盒購自美國Roche公司，嚴(yán)格按說明書操作。用熒光顯微鏡(日本Nikon公司)在波長510～520 nm下觀測TUNEL染色，在波長400～420 nm下觀察Hoechst染色。

四、TRAIL-R1、R2蛋白表達(dá)檢測

取含106胰腺癌細(xì)胞的懸液滴在涂有polylysine的玻片上，加10 μl PE熒光標(biāo)記的鼠抗人TRAIL-R1或TRAIL-R2抗體(美國Diaclone Biosciences公司)，熒光顯微鏡拍照記錄后置流式細(xì)胞儀檢測TRAIL-R1、R2的表達(dá)，根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度分析計(jì)算細(xì)胞TRAIL-R1或TRAIL-R2表達(dá)率。

五、caspase-3蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組織化學(xué)方法檢測caspase-3的表達(dá)。收集細(xì)胞加穿透液(0.1%TritonX-100，0.1%檸檬酸鈉溶液)冰上作用2min，離心后加兔源性caspase-3抗體(1∶100，美國Cell Signaling Technology公司)，洗滌后加Cy-3 熒光標(biāo)記抗兔二抗(1∶1 000，美國Jakson公司)，用熒光顯微鏡拍照記錄，計(jì)算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率

經(jīng)酶切鑒定，pCA13-TRAIL重組質(zhì)粒成功擴(kuò)增出1條860 bp的TRAIL基因條帶，表明攜帶TRAIL的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。SW1990、PaTu8988和BxPC3細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率分別為(69.88±9.92)%、(26.52±10.01)%和(38.60±11.02)%，其中PaTu8988的轉(zhuǎn)染率較低。

二、胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后TRAIL mRNA及蛋白表達(dá)的變化

SW1990、PaTu8988和BxPC3的pCA13-TRAIL組24 h后TRAIL mRNA的表達(dá)量分別為0.5967±0.0605、0.3250±0.0323和0.5033±0.0879，48 h后分別為0.6460±0.0973、0.3367±0.0649和0.5310±0.0776；24 h后TRAIL蛋白的表達(dá)量分別為0.5490±0.0717、0.2813±0.0595和0.4107±0.1084，48 h后分別為0.6227±0.0439、0.3633±0.0541和0.4267±0.0829。pCA13-TRAIL組mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著高于pCA13組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。

三、胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞凋亡率的變化

SW1990、BxPC3、PaTu8988細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRAIL后的細(xì)胞凋亡率均較pCA13組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

四、胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后TRAIL-R1、R2的表達(dá)變化及其與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性

轉(zhuǎn)染TRAIL后SW1990、BxPC3、PaTu8988細(xì)胞TRAIL-R1表達(dá)均上調(diào)，除轉(zhuǎn)染72 h的BxPC3細(xì)胞外，其他各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均顯著高于pCA13組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)；轉(zhuǎn)染TRAIL后SW1990、BxPC3細(xì)胞TRAIL-R2表達(dá)均上調(diào)，除轉(zhuǎn)染24 h的SW1990細(xì)胞外，其他各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均顯著高于pCA13組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而轉(zhuǎn)染TRAIL后PaTu8988細(xì)胞的TRAIL-R2表達(dá)與pCA13組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 3株人胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的細(xì)胞凋亡率

表2 3株人胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的TRAIL-R1、TRAIL-R2陽性表達(dá)率

轉(zhuǎn)染TRAIL后SW1990細(xì)胞的TRAIL-R1、R2表達(dá)與凋亡率均呈正相關(guān)(r值分別為0.764、0.683，P值均<0.05)；PaTu8988細(xì)胞的TRAIL-R1的表達(dá)與凋亡率呈正相關(guān)(r=0.743，P<0.05)，TRAIL-R2表達(dá)與凋亡率呈弱相關(guān)(r=0.507，P=0.093)；BxPC3細(xì)胞的TRAIL-R2表達(dá)明顯升高，與凋亡率呈正相關(guān)(r=0.743，P<0.01)，TRAIL- R1表達(dá)與凋亡率呈弱相關(guān)(r=0.573，P=0.052)。

五、胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后caspase-3蛋白表達(dá)的變化

轉(zhuǎn)染pCA13-TRAIL質(zhì)粒后，SW1990、PaTu8988和BxPC3細(xì)胞caspase-3陽性表達(dá)率分別為(14.64±5.35)%、(9.92±5.50)%和(16.12±6.74)%，均較pCA13組的(3.01±1.50)%、(1.75±0.50)%和(3.79±1.58)% 顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

六、胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變

透射電鏡下可見細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的各種特征(圖1)，細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，胞膜起泡，凋亡小體形成，被鄰近細(xì)胞吞噬。

圖1 轉(zhuǎn)染pCA13-TRAIL后人胰腺癌細(xì)胞株SW1990(1A)、PaTu8988(1B)、BxPC3(1C)電鏡下改變(×7400倍，↑為凋亡細(xì)胞)

討 論

胰腺癌治療手段中，基因和細(xì)胞療法是可行的，并且可以與標(biāo)準(zhǔn)治療和(或)免疫治療協(xié)同抗腫瘤[2]?；蛑委煹挠行О悬c(diǎn)包括抑癌基因p53、K-ras基因突變，抗血管生成基因受體VEGFR、自殺基因HSK-TK，胞嘧啶脫氨酶和細(xì)胞色素P450等[3]。TRAIL通過與其受體TRAIL-R1和TRAIL-R2結(jié)合，誘導(dǎo)死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物的形成，激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4]。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染攜帶基因的病毒質(zhì)粒使動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)目的基因被廣泛運(yùn)用[5]，一種新的嵌合型腺病毒Ad.5/3-mda-7通過提供mda-7/IL-2顯示出更好的療效[6]。本研究利用攜帶TRAIL基因的真核載體pCA13轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)TRAIL表達(dá)上調(diào)，48 h達(dá)高峰，且與細(xì)胞凋亡率升高呈正相關(guān)，提示TRAIL能誘導(dǎo)其受體R1、R2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。BxPC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后TRAIL-R1、R2的表達(dá)量較SW1990、PaTu8988細(xì)胞株低，但轉(zhuǎn)染后凋亡率并不低，可能與其轉(zhuǎn)染后TRAIL-R2表達(dá)量顯著增加有關(guān)，提示TRAIL-R1、R2均參與了TRAIL誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞凋亡。

caspase-3的活性可作為細(xì)胞凋亡的指標(biāo)[7]。有學(xué)者認(rèn)為某些細(xì)胞株對(duì)外源性TRAIL耐藥，但二甲雙胍明顯增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的直腸癌細(xì)胞凋亡，并顯示caspase被激活[8]。本研究結(jié)果也證實(shí)caspase-3的活化在TRAIL所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起一定的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突