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      酪酸梭菌對急性壞死性胰腺炎并發(fā)腹腔內(nèi)高壓大鼠腸道屏障功能及菌群的影響

      2019-07-01 09:50:28江舒曼趙寒冰賈林李偉冬黃耀星嚴清青鄧祺何梓健杜洪
      中華胰腺病雜志 2019年3期
      關(guān)鍵詞:酪酸丁酸梭菌

      江舒曼 趙寒冰 賈林 李偉冬 黃耀星 嚴清青 鄧祺 何梓健 杜洪

      1廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院)消化內(nèi)科,廣州 510180;2廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院)病理科,廣州 510180

      重癥急性胰腺炎(SAP)患者中有50%容易發(fā)生腹腔內(nèi)高壓(intra-abdominal pressure,IAH)[1],國際腹腔間隔室綜合征協(xié)會(WSACS)定義IAH為持續(xù)或反復(fù)的病理性腹腔內(nèi)壓≥12 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)[2]。SAP并發(fā)IAH使患者腸道細菌易位及腹腔內(nèi)感染的機會增加[3]。多年來國內(nèi)外運用連續(xù)血液凈化、p38/p53 MAPK抑制劑或者早期腸內(nèi)營養(yǎng)等方法保護腸屏障功能并運用兩種或多種抗生素對抗腸內(nèi)致病菌的大量繁殖,但對SAP繼發(fā)腸源性感染的預(yù)防及控制效果仍不理想。如何運用益生菌治療各種腸道疾病已成為國內(nèi)外研究的熱點[4]。研究指出,酪酸梭菌及其代謝產(chǎn)物丁酸鹽通過減少炎癥因子的釋放調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)并維持腸屏障功能的穩(wěn)定[5]。本研究構(gòu)建急性壞死性胰腺炎(ANP)并發(fā)IAH大鼠模型,觀察酪酸梭菌及丁酸鹽干預(yù)對其炎癥因子、腸屏障功能、腸道病理學(xué)改變及腸道菌群的影響。

      材料與方法

      一、實驗動物、分組及建模方法

      80只Sprague-Dawley(SD)SPF級雌性大鼠,體重(224±13)g,由南方醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,許可證號SCXK(粵)2016-0041。按數(shù)字表法隨機分為正常對照組(A組)、ANP并發(fā)IAH組(B組)、ANP并發(fā)IAH加酪酸梭菌干預(yù)組(C組)及ANP并發(fā)IAH加丁酸鈉干預(yù)組(D組),C、D組于造模前10 d分別給予酪酸梭菌1×109CFU/d、丁酸鈉100 mg·kg-1·d-1灌胃,A、B組灌入等容積生理鹽水。預(yù)處理后B、C、D組均采用經(jīng)胰膽管注射4.5%牛黃膽酸鈉溶液1 mg/kg體重的方法制備ANP模型[6],A組僅翻動胰腺、胃腸等器官后關(guān)腹。制模后24 h采用左下腹直接穿刺并連接壓力換能器測定大鼠腹腔內(nèi)壓[7],腹腔內(nèi)壓≥12 mmHg確定為IAH。每組隨機抽取10只成功建模的大鼠腹腔動脈血,并取回腸末段組織10 cm。

      二、血液指標檢測

      血標本經(jīng)3 000 r/min離心10 min。全自動生物化學(xué)分析儀(奧林巴斯AU5400,日本)檢測血淀粉酶;免疫酶聯(lián)吸附法(ELISA)檢測TNF-α、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)和D-乳酸水平;采用顯色基質(zhì)鱟試劑測定血漿細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)水平。嚴格按照說明書操作。

      三、回腸組織病理學(xué)檢查及菌群測定

      取4%多聚甲醛固定的回腸末段組織,經(jīng)脫水、透明、透蠟、包埋、切片后行蘇木精-伊紅(HE)染色,由兩位病理科醫(yī)師盲法在光鏡下觀察組織的病理變化,并根據(jù)小腸病理Chiu′s標準[8]進行評分。

      根據(jù)各細菌的16sDNA基因序列設(shè)計特異性PCR引物。采用實時定量PCR方法檢測回腸黏膜酪酸梭菌、乳酸桿菌、普拉梭菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌的細菌數(shù)量,以拷貝數(shù)的對數(shù)值/0.1 g腸黏膜濕重表示。

      四、統(tǒng)計學(xué)處理

      結(jié) 果

      一、各組大鼠腹腔內(nèi)壓力比較

      A、B、C、D組大鼠的腹腔內(nèi)壓力分別為(5.94±0.28)、(14.62±2.68)、(14.92±3.12)、(15.13±2.98)mmHg,B、C、D組均>12 mmHg,均顯著高于A組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05),但B、C、D組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

      二、各組大鼠血指標水平的比較

      B、C、D組大鼠血淀粉酶及TNF-a水平均顯著高于A組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,B、C、D組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義;B、C、D組大鼠血DAO、D-乳酸、LPS水平也均顯著高于A組, 而C、D組的DAO、D-乳酸、LPS水平均顯著低于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但C、D組間DAO、LPS水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

      三、各組大鼠回腸病理評分及菌群比較

      A組大鼠腸黏膜絨毛完整,固有層無淤血;B組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)不完整,上皮絨毛水腫及局部脫落,固有層有炎癥性細胞浸潤,毛細血管擴張淤血;C、D組大鼠腸黏膜病理改變介于A、B兩者之間(圖1)。A、B、C、D組大鼠回腸病理評分分別為(1.20±0.75)、(4.21±0.83)、(2.36±0.38)、(2.03±0.84)分,B、C、D組顯著高于A組,B組又顯著高于C、D組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05),而C、D組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

      B組回腸末段黏膜有益菌(酪酸梭菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、普拉梭菌)數(shù)量較A組顯著減少,而致病菌(腸球菌、大腸埃希菌)顯著增多;C、D組有益菌數(shù)量均顯著高于B組,而致病菌數(shù)量均顯著低于B組;D組酪酸梭菌及腸球菌含量均顯著低于C組。上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05,表2)。

      討 論

      SAP并發(fā)IAH或腹腔間隔室綜合征時由于腸道組織的缺血再灌注、炎癥因子釋放、菌群失調(diào)、腸細胞營養(yǎng)缺失等[9]可引發(fā)腸黏膜屏障功能障礙甚至腸功能衰竭,導(dǎo)致黏膜通透性增高和腸內(nèi)大量致病菌和內(nèi)毒素易位,形成膿毒血癥,同時又可促進炎癥因子釋放,兩者相互影響,易出現(xiàn)多器官衰竭,增加患者的死亡率。近年來益生菌對各種腸道疾病的治療作用受到極大關(guān)注,Bongaerts和Severijnen[10]提出應(yīng)該在胰腺炎發(fā)病初期應(yīng)用大量有代謝活性的益生菌,才能起到調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂,減少后期繼發(fā)感染,從而改善AP疾病病程。

      表1 各組大鼠血指標的變化

      注:與A組比較,aP<0.05;與B組比較,bP<0.05

      圖1 正常對照組(1A)、ANP并發(fā)IAH組(1B)、ANP并發(fā)IAH加酪酸梭菌干預(yù)組(1C)及ANP并發(fā)IAH加丁酸鈉干預(yù)組(1D)大鼠回腸末段黏膜病理變化(HE ×100)

      組別只數(shù)酪酸梭菌雙歧桿菌乳酸桿菌普拉梭菌腸球菌大腸埃希菌A組806.04±0.116.86±0.254.82±0.105.81±0.053.68±0.064.21±0.12B組803.24±0.07a3.26±0.24a2.09±0.06a2.65±0.08a6.93±0.12a7.06±0.37aC組809.81±0.37ab4.68±0.17ab4.01±0.12ab4.35±0.06ab5.76±0.23ab5.91±0.34abD組805.73±1.23abc4.81±0.05ab3.94±0.17ab4.07±0.15ab4.82±0.06abc5.73±0.28ab

      注:與A組比較,aP<0.05;與B組比較,bP<0.05;與C組比較,cP<0.05

      酪酸梭菌是腸道內(nèi)的厭氧菌,它與其代謝產(chǎn)物丁酸鹽可以調(diào)節(jié)腸道免疫及微生態(tài),抑制炎癥通路的激活,從而減少炎癥因子的釋放,維持腸屏障的穩(wěn)定[11-12]。本研究結(jié)果顯示,酪酸梭菌或丁酸鹽干預(yù)后大鼠血LPS、DAO及D-乳酸水平及回腸黏膜病理評分均較未干預(yù)大鼠顯著降低,說明酪酸梭菌及丁酸鹽可以在一定程度上維護腸黏膜屏障,降低腸黏膜及血管內(nèi)皮的通透性。

      腸道細菌在人體里主要存在遠端小腸和結(jié)腸內(nèi),深層緊貼黏膜的由有益菌組成的共生菌形成細菌生物膜可防止致病菌與腸道上皮接觸,對維護腸道正常的生物屏障起重要作用。SAP并發(fā)IAH時腸道缺血再灌注損傷、麻痹性腸梗阻、腸壁水腫等導(dǎo)致腸內(nèi)致病菌大量繁殖。本研究結(jié)果顯示,酪酸梭菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、普拉梭菌等益生菌在未干預(yù)組的數(shù)量明顯低于正常對照組,而大腸桿菌、腸球菌等致病菌的數(shù)量明顯高于正常對照組,提示在SAP并發(fā)IAH時確實存在嚴重腸道菌群失調(diào)。酪酸梭菌或丁酸鹽干預(yù)后4種有益菌數(shù)量均顯著高于未干預(yù)組,兩種致病菌數(shù)量均顯著低于未干預(yù)組,提示酪酸梭菌及丁酸鹽可以促進益生菌生長,抑制致病菌的繁殖。

      總之,酪酸梭菌及其代謝產(chǎn)物丁酸鹽既能維護ANP并發(fā)IAH大鼠的腸屏障功能作用,又能調(diào)節(jié)其腸道菌群失衡,兩者相互促進、相互補充,這一結(jié)果為益生菌治療SAP并發(fā)IAH提供了實驗依據(jù)。

      利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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