狄義寧，劉魯峰，胡一凡，謝林艷，李詠梅，何鵬杰，崔文艷，何鵬飛，李富生，3*，何麗蓮，3*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所 云南 昆明 650201）

甘蔗是重要的糖料作物和能源作物［1］，其內(nèi)部存在大量的內(nèi)生菌。從1961年開(kāi)始，中外研究者從甘蔗中分離出了大量?jī)?nèi)生菌。植物內(nèi)生菌（endophyte）指能夠在健康植物活組織中生存而不引起寄主植物明顯病變的一大類微生物，是一類豐富的微生物資源，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌?，F(xiàn)目前已從上百種植物中分離得到內(nèi)生菌［2］，其主要寄生于植物細(xì)胞內(nèi)、 細(xì)胞間隙［3-4］或木質(zhì)部和韌皮部的維管束系統(tǒng)［5］。種類包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的71個(gè)屬的 219 個(gè)種［6］，不同寄主植物與內(nèi)生菌組成之間存在著差異，它們與植物長(zhǎng)期互惠互利，共同生活，形成了獨(dú)特的生態(tài)位。在植物為其提供一個(gè)更加安全穩(wěn)定的生存環(huán)境下，細(xì)菌也利用著植物包括根系分泌物、裂解物等在內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并且它們也合成分泌一些代謝產(chǎn)物從而影響植物生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)大部分從健康植物根組織中分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌與植物根際促生細(xì)菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）相似［7］，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用［8］。其促進(jìn)機(jī)制主要包括：（1）產(chǎn)生促植物生長(zhǎng)物質(zhì)，如植物生長(zhǎng)素、赤霉素以及細(xì)胞分裂素等，直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)；（2）活化養(yǎng)分作用，活化養(yǎng)分主要指如PGPR菌株能夠提高土壤中的可利用養(yǎng)分量，即通過(guò)解磷、解鉀、固氮及鐵螯合等作用，為植物提供更多可利用的N、P、K及Fe等元素［9］；（3）改變根部周?chē)沫h(huán)境來(lái)緩解非生物壓力，如分泌胞外多糖來(lái)改變土壤結(jié)構(gòu)，從而增加植物根部對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)［10］。不僅如此，內(nèi)生菌還會(huì)產(chǎn)生與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間（如鐵載體［11-12］的產(chǎn)生），或直接產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，從而抑制病原菌，間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)。研究也證明，內(nèi)生菌定殖能力的強(qiáng)弱與數(shù)量直接影響著植株的生長(zhǎng)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)水平的提高，綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記技術(shù)以其性能穩(wěn)定，表達(dá)與受體細(xì)胞無(wú)關(guān)，方便檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)被許多研究者所采用［13］。內(nèi)生菌具有深遠(yuǎn)的開(kāi)發(fā)價(jià)值［14］，被譽(yù)為促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育最大潛在微生物資源［15］。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

供試菌株是本課題組從種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗資源圃內(nèi)的“云蔗99-91”根部組織中篩選得到的1株內(nèi)生細(xì)菌，編號(hào)為B9（Genbank登錄號(hào)：MH935511）；促生正對(duì)照專利菌株Y2（專利號(hào)：ZL200310104195.6）［16］與攜帶氨芐青霉素和氯霉素雙重抗性標(biāo)記的pHT01-P43GFPmut3a質(zhì)粒由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)何月秋教授惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基包括：①LB培養(yǎng)基；②Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基［17］；③ Pikovskaya（簡(jiǎn)稱 Pvk）培養(yǎng)基［18］；④NBRIP培養(yǎng)基［19］；⑤植酸鈣培養(yǎng)基［20］；⑥優(yōu)化解鉀培養(yǎng)基（葡萄糖5 g，硫酸銨0.5 g，酵母粉0.5 g，硫酸鎂0.3 g，磷酸氫二鈉2 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，鉀長(zhǎng)石2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2）；⑦ Landy培養(yǎng)基［20］；⑧ LNM 培養(yǎng)基。B9，Y2菌株36 ℃培養(yǎng)；⑨MS培養(yǎng)基（常規(guī)配方）。

1.3 盆栽基質(zhì)與供試作物

盆栽基質(zhì)配方為草泥炭、珍珠巖、蛭石（2∶0.5∶1 v/v/v，每1 kg基質(zhì)中混入0.4%磷礦粉與0.3%硝酸鉀），121℃。0.1 MPa高溫滅菌30 min備用。供試作物為玉米云禾單2號(hào)，盆栽甘蔗為ROC10號(hào)。組培苗為ROC22號(hào)無(wú)菌脫毒組培苗。

1.4 內(nèi)生菌的鑒定

1.4.1 傳統(tǒng)鑒定方法

將B9在LB平板培養(yǎng)48 h，觀察其形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色；按照常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)方法，進(jìn)行檸檬酸鹽的利用、淀粉水解、硝酸鹽還原、吲哚產(chǎn)生、明膠液化、硫化氫試驗(yàn)等生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.4.2 現(xiàn)代基因片段測(cè)序

待測(cè)各菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，提取細(xì)菌的基因組DNA［21］，擴(kuò)增16S rRNA、gyrB、rpoB片段后由公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件拼接，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性較高模式菌株的序列使用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap重復(fù)值設(shè)置1 000，確定菌株的分類地位。

1.5 B9菌固氮能力初探與其溶磷解鉀能力的測(cè)定

挑取活化后菌株單菌落，接種于Ashby，Pvk，NBRIP，植酸鈣固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。4 d后測(cè)量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），計(jì)算透明圈與菌落直徑比（D/d），溶磷能力定量測(cè)定采用以無(wú)機(jī)磷源磷酸三鈣［22］、有機(jī)磷源植酸鈣為底物進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，以不接菌搖瓶CK為對(duì)照，放于36℃，160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，接種后1、3、5、7、9 d分別吸取發(fā)酵液測(cè)定發(fā)酵液pH值，并用鉬藍(lán)法［23］測(cè)定可溶性磷含量，細(xì)菌解鉀能力的測(cè)定［24］采用火焰光度法檢測(cè)上清液中的鉀含量［23］。

1.6 吲哚-3-乙酸（IAA）的定量測(cè)定

IAA的定量測(cè)定參照文獻(xiàn)［25］采用Salkowski比色法對(duì)IAA進(jìn)行比色測(cè)定，IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線采取IAA標(biāo)準(zhǔn)品制作。

1.7 嗜鐵素的分類及其測(cè)定

采用CAS平板法，液體法進(jìn)行嗜鐵素活性測(cè)定，采用 FeCl3試驗(yàn)［26］、高氯酸鐵試驗(yàn)［27］、Arnow 等試驗(yàn)［28］及 Shenker等試驗(yàn)［29］分析和確定菌株產(chǎn)生嗜鐵素的類型以及嗜鐵素相對(duì)含量。

1.8 細(xì)菌菌株對(duì)甘蔗幼苗、玉米種子的促生長(zhǎng)作用

1.8.1 菌株活化備用

將供試菌株放于LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)36 h，后將菌液經(jīng)12 000 r/min離心收集沉淀，無(wú)菌水重懸，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為106、107、108cfu/mL備用。

1.8.2 浸種發(fā)芽試驗(yàn)

選擇飽滿健康的玉米種子，75%酒精進(jìn)行表面消毒，用上述3個(gè)梯度的菌液分別浸泡種子，無(wú)菌清水為空白對(duì)照，Y2菌液處理為正對(duì)照，每個(gè)處理30顆種子，重復(fù)3次，50 h后觀測(cè)發(fā)芽情況，記錄發(fā)芽勢(shì)，種子胚芽與胚根長(zhǎng)度。

1.8.3 盆栽試驗(yàn)

采用單芽苗催芽致鸚鵡嘴時(shí)期，移栽至基質(zhì)中。處理為CK（清水）與B9菌液處理，控制菌含量為1×107cfu/g，灌根法澆施，每個(gè)處理6次重復(fù)，共12株苗。于出現(xiàn)性狀差異后，測(cè)量株高、莖粗、鮮重、干重、葉綠素、根系活力及其植株氮磷鉀［30］等農(nóng)藝性狀與理化性質(zhì)。

1.9 B9菌株的自然轉(zhuǎn)化及其穩(wěn)定性測(cè)定

B9的自然轉(zhuǎn)化具體操作見(jiàn)參考文獻(xiàn)［31］，被標(biāo)記的熒光工程菌株命名為B9-P43GFPmut3a。穩(wěn)定性檢測(cè)采用楊秀榮［32］方法進(jìn)行。

1.10 B9菌在甘蔗幼苗內(nèi)部定殖研究

選取已生根并長(zhǎng)勢(shì)基本一致的無(wú)菌脫毒ROC22甘蔗組培單苗，移裝至含有20 mL的1/10MS液體培養(yǎng)液的玻璃試管中，培養(yǎng)基不含維生素，也未添加任何激素。周期為1、5、10、15、20、25、30、35、45、55 d，分別稱取根莖葉0.1 g，消毒（75%酒精1 min，2%次氯酸鈉2 min）并研磨涂板與含有10 μg/mL的氯霉素LB固體平板，以最后一次無(wú)菌水沖洗留下的沖洗液無(wú)菌生長(zhǎng)的條件下，統(tǒng)計(jì)根莖葉，平板在光電折射儀下觀察熒光菌數(shù)量，計(jì)算平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落的特征、鑒定與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析

B9菌在37℃在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，菌落特征見(jiàn)表1。生理生化鑒定結(jié)果B9符合芽孢桿菌特征，見(jiàn)表2。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果中，B9菌在16S rRNA基因水平上與Bacillus subtilis strain CICC 10366同源一致性達(dá)到99%，gyrB基因水平上與Bacillus subtilis strain ATCC 21228達(dá)99%，rpoB與Bacillus subtilis strain ATCC 21228標(biāo)準(zhǔn)菌同源性達(dá)98%，在圖1中，B9與Bacillus subtilis strain DSM 10T模式菌株歸為同一分支，結(jié)合同源一致性大于98%則可判定統(tǒng)一菌種，B9菌最終鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表1 B9的菌落形態(tài)觀察與生理生化測(cè)定

表2 細(xì)菌16S rRNA、gyrB、rpoB基因片段在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)結(jié)果

圖1 最大似然法構(gòu)建B9菌16S rRNA片段進(jìn)化樹(shù)

2.2 菌株固氮、溶磷、解鉀能力測(cè)定

由表3可知，B9在Ashby培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，菌落顏色為黃白色，且有固氮圈的出現(xiàn)，可初步推斷B9能產(chǎn)生固氮酶，依靠空氣中的氮進(jìn)行生長(zhǎng)；除了在植酸鈣培養(yǎng)基中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的溶磷圈外，在Pvk、NBRIP平板上，均發(fā)現(xiàn)了溶磷圈。從圖2液體培養(yǎng)基中可發(fā)現(xiàn)，對(duì)比不接菌空白對(duì)照，在Pvk（A），NBRIP（B）兩個(gè)以 Ca3（PO4）2難溶性磷酸鹽為底物的培養(yǎng)基中，接種B9菌，可溶性磷含量明顯增加，B9菌在PVK、NBRIP培養(yǎng)基中7 d時(shí)可溶性磷含量最多，分別達(dá)（29.02±0.26）mg/L、（19.96±0.97）mg/L。在以植酸鈣為底物的培養(yǎng)液（圖2C）中，可溶性磷含量在9 d達(dá)到最大，溶磷量為（101.65±1.41）mg/L，可見(jiàn)，B9菌對(duì)不同磷源溶磷強(qiáng)弱分別為植酸鈣＞磷酸三鈣，具有一定的溶磷能力；在解鉀培養(yǎng)基（圖2D）中，7 d解鉀量達(dá)最大值，為（5.455±0.135）mg/L。由圖2A、B、C 3個(gè)圖中還可看出，接種B9之后，培養(yǎng)基pH值低于空白CK，由此猜測(cè)其溶磷機(jī)制與產(chǎn)生有機(jī)酸有關(guān)。

表3 試驗(yàn)菌株在平板上的固氮與溶磷效果（5 d）

圖2 B9菌在Pvk（A）、NBRIP（B）、植酸鈣（C）、解鉀液體培養(yǎng)基（D）中的溶磷解鉀情況

由圖3可見(jiàn)，在加入3 mmol/L色氨酸與不加兩個(gè)培養(yǎng)基之間，IAA的產(chǎn)生量顯著不同，B9菌在不含IAA的Landy液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4 d時(shí)IAA含量最高，達(dá)到（1.914±0.11）μg/mL，在含有色氨酸為底物情況下，IAA在3 d時(shí)含量最多，為（63.067±2.49）μg/mL。在細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大后，培養(yǎng)基中的IAA含量逐漸上升，隨后下降。對(duì)于B9產(chǎn)生的嗜鐵素初步推測(cè)為混合型（Mixed ligand）嗜鐵素，因?yàn)橥瑫r(shí)具有異羥肟酸型、兒茶酚型及羧酸型嗜鐵素的特征，含有兩類或兩類以上螯合基團(tuán)的嗜鐵素，LNM培養(yǎng)基中相對(duì)含量為26%。

2.3 菌液處理對(duì)玉米種子發(fā)芽情況及對(duì)甘蔗幼苗盆栽試驗(yàn)農(nóng)藝性狀與生理生化指標(biāo)的影響

在菌液處理玉米種子50 h后，測(cè)量玉米的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)，B9和Y2處理均比清水對(duì)照生長(zhǎng)更長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)更好，芽長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于清水對(duì)照，根長(zhǎng)更達(dá)到了極顯著差異。B9催芽生根效果與空白清水對(duì)照和Y2處理相比，根長(zhǎng)分別增加456.52%、93.94%，芽長(zhǎng)分別增加100%、16.28%。結(jié)合表5數(shù)據(jù)得到B9的催芽生根最適濃度為106cfu/mL。同時(shí)B9處理提高玉米種子萌發(fā)率，與Y2相同，均比清水對(duì)照提高33.3%。

圖3 B9在有無(wú)色氨酸的Landy培養(yǎng)基產(chǎn)生IAA與活菌數(shù)之間的關(guān)系

表4 B9菌產(chǎn)生嗜鐵素的種類及相對(duì)含量

表5 菌液重懸液對(duì)玉米種子根芽組織促生效果

在B9處理對(duì)甘蔗幼苗灌根處理后，由圖4與表6可見(jiàn)，處理組在葉綠素、根系活力指標(biāo)中均高于清水，株高平均為（1.110±0.152）m，較清水空白對(duì)照增加13.1%，根長(zhǎng)為（0.456±0.133）m，較清水增加62.85%，莖粗增加28.49%，在鮮重、干重方面，分別增加43.53%、34.03%，都與清水存在顯著差異。在植株氮磷鉀含量測(cè)定中（表7），B9處理組顯著高于清水對(duì)照，莖部氮磷鉀分別增加5.2%、0%、12.82%，葉部氮磷鉀分別增加7.1%、1.8%、16.67%。

圖4 盆栽試驗(yàn)中B9處理對(duì)甘蔗苗株生理生化指標(biāo)的影響

表6 盆栽試驗(yàn)中B9處理對(duì)甘蔗苗株農(nóng)藝性狀的影響

表7 接種B9對(duì)甘蔗植株地上部分氮磷鉀元素含量的影響 （g/kg）

2.4 熒光菌株的穩(wěn)定性檢測(cè)與植株內(nèi)的定殖情況

試驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，連續(xù)培養(yǎng)20 h后其遺傳穩(wěn)定性為97.39%，芽孢桿菌在實(shí)驗(yàn)室適宜條件下大約30 min能分裂一代，而其在自然條件下分裂一代所需時(shí)間在50～100 h之間［33］，因此認(rèn)為構(gòu)建的B9-P43GFPmut3a基因工程菌可以滿足作物特定周期供研究的需要。為期55 d的跟蹤檢測(cè)結(jié)果（圖6）表明，定殖于甘蔗根部的菌量最大，在接種1 d后就在根部檢測(cè)到106～107cfu/g的熒光菌，后期穩(wěn)定在105～107cfu/g含量之間，定殖與葉部及莖部的數(shù)量較根相比略少，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，數(shù)量呈現(xiàn)小幅上升，其中莖部穩(wěn)定在103～105cfu/g，葉部穩(wěn)定在103～104cfu/g，在激光共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn)綠色的菌體定殖在甘蔗根部，形成一層保護(hù)膜（圖7e），由此可見(jiàn)，B9-P43GFPmut3a均能夠在甘蔗根、莖、葉形成有效定殖。

圖6 標(biāo)記菌株B9-P43GFPmut3a在甘蔗體內(nèi)的定殖的回收檢測(cè)

圖5 B9-P43GFPmut3a穩(wěn)定性檢測(cè)

圖7 標(biāo)記菌株B9-P43GFPmut3a在甘蔗體內(nèi)的定殖情況

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)的創(chuàng)新之處在于B9雖然分離于甘蔗品種云蔗99-91，但是在探究其促生長(zhǎng)功能時(shí)，筆者加入了與甘蔗同科不同屬的玉米作為試驗(yàn)對(duì)象，比較了內(nèi)生菌在不同寄主的情況下的促生效應(yīng)，擴(kuò)大了B9內(nèi)生菌的使用范圍，同時(shí)對(duì)玉米糧食產(chǎn)業(yè)的增產(chǎn)增收也具有重大意義，試驗(yàn)后續(xù)將探究B9菌是否能對(duì)更多作物產(chǎn)生促生長(zhǎng)效果，通過(guò)在不同作物上取得的效果，深化研究?jī)?nèi)生菌與植物的識(shí)別機(jī)制。

枯草芽孢桿菌于1872年被正式命名，其因?yàn)楫a(chǎn)生內(nèi)生芽孢，耐熱抗逆性強(qiáng)，在土壤和植物的表面普遍存在從而被廣泛分離［34］，又因其不污染環(huán)境，對(duì)人畜無(wú)害，生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，易于存活、定殖與繁殖，無(wú)致病性，并可以分泌多種酶與抗生素，而且還具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖及科學(xué)研究等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。隨著研究進(jìn)一步深入，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)部也存在枯草芽孢桿菌，但對(duì)其生物學(xué)功能研究的報(bào)道還與非內(nèi)生枯草芽孢桿菌如FZB42等相比有一定差距。在測(cè)定B9菌生物學(xué)特性試驗(yàn)中，B9能在無(wú)氮源培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，并出現(xiàn)透明固氮圈，并在后期盆栽試驗(yàn)中，顯著增加蔗苗的生物量與全氮含量，表明其具有固氮酶活性與固氮功能。本研究不足之處在于沒(méi)有通過(guò)乙炔還原法對(duì)固氮酶活性進(jìn)行定量測(cè)定，該內(nèi)容與固氮酶基因nifH等的克隆與分類將在下一階段研究中繼續(xù)報(bào)道；溶磷能力方面，綜合目前對(duì)篩選溶磷菌的報(bào)道，溶磷細(xì)菌溶磷能力一般多在19.2～519.7 mg/L范圍內(nèi)，多由土壤以及植物根際篩選分離，種類多為芽孢桿菌和假單胞菌。B9在以磷酸三鈣為底物的磷源培養(yǎng)基中溶磷量為（29.02±0.26） mg/L，此數(shù)值與眾多非芽孢陰性菌相比稍顯遜色，但相比內(nèi)生芽孢菌而言，如王辰月等［35］在線葉嵩草中分離的枯草芽孢桿菌LXA10，對(duì)無(wú)機(jī)磷的溶解能力為28.14 mg/L，B9溶磷能力略顯優(yōu)勢(shì)，同時(shí)B9菌在以有機(jī)磷源植酸鈣為底物時(shí)，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的溶磷能力。B9菌針對(duì)不同磷源溶磷能力強(qiáng)弱依次為有機(jī)磷＞無(wú)機(jī)磷，對(duì)有機(jī)磷源的溶磷能力更強(qiáng)；B9菌解鉀量為（5.455±0.135）mg/L，許多研究發(fā)現(xiàn)解鉀菌在不同環(huán)境，不同菌種之間解鉀量存在差異，相比于其他高效解鉀菌的解鉀效率，B9菌略低。但在盆栽回接試驗(yàn)中，通過(guò)測(cè)定甘蔗莖部及葉部的全氮、全磷、全鉀含量，植株的葉綠素與根系活力，試驗(yàn)結(jié)果顯示，B9處理的蔗苗在氮、磷、鉀、葉綠素、根系活力水平上均高于清水對(duì)照，從植株理化性質(zhì)證實(shí)了B9的固氮、溶磷、解鉀能力。

對(duì)促生菌株IAA產(chǎn)生量的定量分析，嗜鐵素的產(chǎn)生與種類，包括在植株內(nèi)部的定殖情況計(jì)數(shù)分析，是目前對(duì)于研究促生機(jī)制的常用手段，但其意義也非常重要，試驗(yàn)結(jié)果B9菌在無(wú)色氨酸為底物的情況下IAA產(chǎn)生量為（1.914±0.11）μg/mL，在增加色氨酸后，IAA產(chǎn)生量大幅度提高，達(dá)到（63.067±2.49）μg/mL。B9產(chǎn)生鐵載體類型為混合型鐵載體，其因含有兩類或兩類以上螯合基團(tuán)的嗜鐵素，同時(shí)具有異羥肟酸型、兒茶酚型及羧酸型嗜鐵素的特征［36］，該結(jié)果可以推斷，在低鐵的環(huán)境下，B9產(chǎn)生的鐵載體對(duì)鐵具有更強(qiáng)的結(jié)合作用。菌株B9能促進(jìn)玉米種子萌發(fā)以及促進(jìn)其胚芽，胚根長(zhǎng)度發(fā)育初步推斷是產(chǎn)生IAA等激素導(dǎo)致，當(dāng)菌液濃度過(guò)高，產(chǎn)生IAA濃度偏大反而對(duì)種子發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。在定殖前期，筆者也對(duì)轉(zhuǎn)化成功的基因工程菌B9-P43GFPmut3a與野生菌株B9進(jìn)行了玉米催芽與甘蔗組培苗促生長(zhǎng)試驗(yàn)，二者并無(wú)差異，證明工程菌的促生長(zhǎng)特性并未發(fā)生改變，其在甘蔗根、莖、葉內(nèi)定殖檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。菌株鑒定通過(guò)比對(duì)三大看家基因（16S rRNA，gyrB，rpoB）的檢測(cè)，彌補(bǔ)了單純使用16S rRNA基因片段的不足；在進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建方面采用了較鄰接法更為準(zhǔn)確的最大似然法，加上外觀形態(tài)與生理生化指標(biāo)，更加系統(tǒng)和全面。上述結(jié)果對(duì)豐富甘蔗有益內(nèi)生菌種類和開(kāi)發(fā)應(yīng)用生物菌肥提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐，但田間驗(yàn)證試驗(yàn)和大田應(yīng)用研究還有待下一步開(kāi)展。