郭 敬，易美琴，宋 波

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637000)

環(huán)境脅迫是不同的環(huán)境因子對(duì)生物所處的生存狀態(tài)產(chǎn)生的壓力，如水分虧缺、pH、高溫、鹽堿、環(huán)境污染等環(huán)境因子都會(huì)對(duì)生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生壓力。食用菌在生長(zhǎng)和發(fā)育的不同階段溫度、光照、含水量等環(huán)境因子的不適宜都會(huì)影響菌絲體的正常生長(zhǎng)，最終影響食用菌的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。溫度是食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最重要的影響因素，在不同的溫度下食用菌產(chǎn)生的酶量不同，酶的活性高低也不同，這些不同是菌體適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。在食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，胞外酶將培養(yǎng)料的大分子裂解成能使菌絲和子實(shí)體利用的小分子物質(zhì)，為食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)食用菌的生長(zhǎng)，因此，胞外酶在食用菌的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程都起著非常重要的作用。當(dāng)培養(yǎng)的溫度和pH值改變時(shí)，食用菌菌絲體的胞外酶和保護(hù)酶也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)變化[2-5]。

中國(guó)的食用菌菌種資源豐富,白玉菇、真姬菇、杏鮑菇是目前常見(jiàn)的工廠(chǎng)化大規(guī)模栽培食用菌。目前關(guān)于溫度脅迫對(duì)食用菌酶活性影響的研究報(bào)道極少，僅限于白靈側(cè)耳、銀耳等少數(shù)食用菌的報(bào)道，對(duì)白玉菇、真姬菇、杏鮑菇尚未研究[6-7]。本研究以三種常見(jiàn)食用菌為實(shí)驗(yàn)材料探究不同溫度和PH脅迫下，食用菌菌絲酶的活性變化，通過(guò)測(cè)定纖維素酶和淀粉酶兩種胞外酶以及過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)兩種保護(hù)酶活性的變化，以期找出在溫度脅迫下三種食用菌對(duì)培養(yǎng)料的分解的程度以及利用率，探究食用菌菌絲酶活性的動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步研究食用菌的營(yíng)養(yǎng)生理過(guò)程提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

白玉菇、杏鮑菇、真姬菇均購(gòu)自南充某公司。

1.2 供試培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、酵母浸膏1g、瓊脂20g。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

不銹鋼立式壓力滅菌鍋；恒溫?fù)u床THZ-92A，上海浦東物理光學(xué)儀器廠(chǎng)；電子天平，BS223S，Sartorius；生化培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)SW-CJ-IFD，蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV752N紫外可見(jiàn)分光廣度計(jì)，上海佑科。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種的活化 用解剖刀從經(jīng)過(guò)表面消毒的白玉菇、真姬菇、杏鮑菇菌蓋中部縱切一刀,切取一小塊組織,移接到平板培養(yǎng)基上封口，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，23℃培養(yǎng),數(shù)天后可見(jiàn)組織塊上長(zhǎng)出絨毛狀菌絲，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板后備用。

1.4.2 溫度脅迫處理方法 先將菌絲接種于斜面固體培養(yǎng)基中放置于23℃(正常生理環(huán)境)培養(yǎng)一段時(shí)間，當(dāng)菌絲長(zhǎng)度長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的2/5時(shí)，進(jìn)行溫度脅迫處理。將試驗(yàn)組分別放置在4℃、35℃環(huán)境下培養(yǎng)，對(duì)照組繼續(xù)于23℃下培養(yǎng)。在處理后的第2天開(kāi)始，每隔1d,取帶培養(yǎng)基的菌絲塊,進(jìn)行相關(guān)酶活的測(cè)定。

1.4.3 酶的提取胞外酶的提取參照文獻(xiàn)[8]取菌絲培養(yǎng)基2g加入20mL的pH值4.8的0.1M乙酸鹽緩沖溶液，23℃下250r/min下振蕩浸提3h，過(guò)濾、定容至22mL，4℃、3500r/min離心10min，取上清(上清液即為粗酶液)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

保護(hù)酶的提取參照文獻(xiàn)[8]：取菌絲培養(yǎng)基2g加入8mL、0.05mol/L，pH值7.0的磷酸緩沖液研缽中，充分勻漿，于4℃、10000r/min離心10min，取上清(上清液即為粗酶液)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 胞外酶的測(cè)定方法 羧甲基纖維素酶活性和淀粉酶活性的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[9]略有改動(dòng)。

表1 測(cè)定胞外酶活性時(shí)各試劑加入量

50℃水浴糖化30min,取出后立即于100℃水浴中煮沸15min，得糖化液，取糖化液0.5ml，加3,5-DNS顯色劑1ml，在100℃水浴中顯色15min，冷卻后加加入蒸餾水11ml，混勻，于分光光度計(jì)550nm處比色，定義酶促生成1μg/h葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.4.5 保護(hù)酶SOD的測(cè)定方法 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用核黃素-NBT法測(cè)定[10]。

表2 測(cè)定SOD活性時(shí)各試劑加入量

SOD反應(yīng)介質(zhì)最后加入，4號(hào)試管加入SOD反應(yīng)介質(zhì)遮光處理，所有試管混合均勻后置于生化培養(yǎng)箱中光照顯色30min(各管照光一致，反應(yīng)溫度24～35℃)，結(jié)束后，避光終止反應(yīng)，以4號(hào)試管作空白(調(diào)零)，在560nm下測(cè)吸光度。

1.4.6 保護(hù)酶POD酶的測(cè)定方法 過(guò)氧化物酶活性(POD)采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]。

取2支試管，在一支試管中加入反應(yīng)混合液3mL，KH2P04lmL作為調(diào)零對(duì)照，另一支試管中加入反應(yīng)混合液3mL，保護(hù)酶粗酶液1mL，反應(yīng)20min后，在470nm下測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度脅迫對(duì)菌絲胞外酶的影響

2.1.1 溫度脅迫下CMC酶活性的變化趨勢(shì) 如圖1所示經(jīng)過(guò)35℃高溫處理之后24h后參考對(duì)照組

圖1 溫度脅迫下三種供試菌種CMC酶活性的變化趨勢(shì)

(23℃)變化，高溫脅迫時(shí)，杏鮑菇CMC酶活性在開(kāi)始階段快速下降，到第4天時(shí)酶活性?xún)H為初始活性的54%，之后趨于穩(wěn)定；低溫脅迫時(shí)，CMC酶活性先升高，第4天達(dá)到最大值酶活性為初始活性的1.35倍，之后快速下降。而真姬菇在高溫脅迫下CMC酶活性在起初逐漸升高，第4天的酶活性約為第2天的1.3倍，之后迅速下降，在脅迫第6天時(shí)酶活性下降50%；而在低溫脅迫下，真姬菇CMC酶活性一直處于下降趨勢(shì)，第2天到第4天下降趨勢(shì)較為緩慢，第6天的酶活性?xún)H為第2天的43%。整體上，真姬菇菌絲處于高溫時(shí)，CMC酶活性都要低于正常溫度；處于低溫時(shí)，CMC酶活性都要高于正常溫度。與杏鮑菇和真姬菇都不同，參考對(duì)照組(23℃)變化，溫度過(guò)高時(shí)，白玉菇菌絲CMC酶活性增加幅度相當(dāng)明顯，在第4天達(dá)到最大值酶活性上升2.28倍，然后開(kāi)始下降；而在溫度過(guò)低時(shí)，白玉菇菌絲CMC酶活性呈先下降后上升的趨勢(shì)，但變化幅度較小。

2.1.2 溫度脅迫下淀粉酶變化趨勢(shì) 如圖2所示在溫度脅迫下，杏鮑菇淀粉酶活性皆先降低，在第4

圖2 溫度脅迫下淀粉酶活性的變化趨勢(shì)

天降到最小值，然后升高。整體上，高溫脅迫下杏鮑菇菌絲淀粉酶活性比正常溫度低而低溫脅迫下，淀粉酶活性高于低于正常溫度。而真姬菇淀粉酶活性在高溫脅迫下起初升高，在第4天酶活性約為第2天的1.4倍，之后迅速下降，在脅迫第6天時(shí)接近于零；而在低溫脅迫下，真姬菇淀粉酶活性一直下降趨勢(shì)，最后趨近于零。而白玉菇淀粉酶活性先下降，在第4天到最小值，酶活性約為第2天的0.5倍之后呈上升趨勢(shì)態(tài)；不同于杏鮑菇的是，整體上，白玉菇菌絲處于高溫時(shí)，淀粉酶活性都要低于正常溫度；處于低溫時(shí)，淀粉酶活性與正常溫度相當(dāng)。

由此可以看出不同溫度差異下，3種食用菌的胞外酶活性變化較為明顯。測(cè)定結(jié)果表明，杏鮑菇在高溫脅迫下，CMC酶活性下降，而真姬菇和白玉菇酶活性先升高后降低；而在低溫脅迫下，杏鮑菇CMC酶活性先升高后降低，真姬菇酶活性持續(xù)下降，白玉菇酶活性先降低后升高。而在受到溫度脅迫時(shí)，3種食用菌的淀粉酶活性都急劇變化，杏鮑菇與白玉菇變化趨勢(shì)相近，在高溫和低溫脅迫下，淀粉酶活性都先降低后升高，而真姬菇在低溫脅迫下酶活性持續(xù)下降，在高溫脅迫下酶活性先上升后下降。說(shuō)明3種食用菌的菌絲胞外酶對(duì)溫度脅迫比較敏感。

2.2 溫度脅迫對(duì)菌絲保護(hù)酶的影響

2.2.1 溫度脅迫下SOD活性的變化趨勢(shì)

圖3 溫度脅迫下SOD活性的變化趨勢(shì)

如圖3：溫度變化引起杏鮑菇SOD活性升高，在高溫脅迫下，杏鮑菇菌絲酶活在第4天迅速增加約3.5倍達(dá)到最大值，之后迅速下降；而在低溫脅迫下，杏鮑菇菌絲SOD活性一直升高。與杏鮑菇不同，高溫使真姬菇活性先升高，在第4天后快速下降；而低溫使真姬菇活性緩慢下降，最后略高于對(duì)照組SOD活性。與真姬菇SOD變化大致相同，高溫脅迫使白玉菇菌絲活性先升高，在第4天后急劇下降；而不同的是，低溫下白玉菇活性緩慢下降，趨勢(shì)與對(duì)照組近似平行。

2.2.2 溫度脅迫下POD活性的變化趨勢(shì)

圖4 溫度脅迫下POD活性的變化趨勢(shì)

如圖4：參考對(duì)照組(23℃)變化，溫度過(guò)高時(shí)，杏鮑菇菌絲POD活性開(kāi)始階段呈下降趨勢(shì)；而溫度過(guò)低時(shí)，杏鮑菇POD活性持續(xù)升高，后期生長(zhǎng)階段中升幅不大。與杏鮑菇不同，與對(duì)照組相比，高溫脅迫下，真姬菇POD活性趨于穩(wěn)定狀態(tài)，但要低于正常溫度時(shí)的POD活性；低溫脅迫下，真姬菇POD活性起初升高，第4天達(dá)到最大值，然后開(kāi)始降低，最后趨近于零。

與杏鮑菇和真姬菇不同，在高溫脅迫下，白玉菇POD活性起初呈上升狀態(tài)，第4天達(dá)到最大值，然后開(kāi)始下降，最后趨近于零；而在低溫脅迫下，白玉菇菌絲POD活性呈穩(wěn)定升高趨勢(shì)。

3 討論

3.1 胞外酶與食用菌逆境生長(zhǎng)的關(guān)系

食用菌是一類(lèi)沒(méi)有葉綠素的異養(yǎng)型真核生物，其主要依靠產(chǎn)生多種胞外酶來(lái)分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以維持其生命活動(dòng)，完成生活史。由此可見(jiàn)，胞外酶的活性高低決定食用菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解程度和效率，影響著其對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用率，也間接影響著食用菌的產(chǎn)量和品質(zhì)[11]。通過(guò)實(shí)測(cè)定結(jié)果得出：在食用菌菌絲生長(zhǎng)階段，胞外酶活性在受到溫度脅迫時(shí)，酶活性有一定影響，在低溫環(huán)境下影響效果不大；胞外酶活性變化與環(huán)境有關(guān)，但環(huán)境不是決定性因素，主要起決定性作用的是食用菌的種性，即不同菌種在不同環(huán)境下，胞外酶的活性變化差異顯著，這主要是受遺傳因素的影響。

3.2 保護(hù)酶與食用菌逆境生長(zhǎng)的關(guān)系