楊 燃，宋洪波，黃 群,*，劉麗莉，邱 寧，馬美湖

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

雞蛋清具有重要的生理作用，其黏稠特性可為蛋黃和孵化中的雞胚提供減振緩沖和物理防護作用[1-2]。在孵化過程中，雞蛋清逐漸被雞胚吸收，為胚胎提供水分和營養(yǎng)物質(zhì)[3]。此外，雞蛋清中含有溶菌酶、抗生物素結(jié)合蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白等多種抗菌蛋白質(zhì)，形成抵抗微生物入侵的化學(xué)屏障[4-5]。因雞蛋清蛋白質(zhì)具有優(yōu)異的熱凝膠性和起泡性，除了發(fā)揮生理作用和營養(yǎng)功能，其亦被作為食品加工的重要原料和輔料。

磷酸化修飾對雞蛋清蛋白質(zhì)的生物活性和加工特性均具有重要影響。研究表明，磷酸化可使卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加，并增強其抗菌活性[6-7]；磷酸化卵白蛋白可促進(jìn)腸道對鐵的吸收[8]。此外，化學(xué)磷酸化改性蛋清粉的乳化活性及穩(wěn)定性都有一定程度地提高[9]，且其起泡性與泡沫穩(wěn)定性都顯著提高[10]；卵白蛋白的化學(xué)磷酸化修飾亦能增強其凝膠性及在油-水界面的穩(wěn)定性[11-12]。

然而，當(dāng)前的研究主要集中在雞蛋清及其主要蛋白（如卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白）的化學(xué)磷酸化修飾方面，對雞蛋清蛋白質(zhì)自身的翻譯后磷酸化修飾尚鮮有系統(tǒng)的研究與報道?；诖?，本研究通過固定化金屬螯合親和層析（immobilized metal chelate affinity chromatography，IMAC）富集雞蛋清磷酸肽，并基于納升液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（nano-liquid chromatography-tandem mass spectrometry，nLC-MS/MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)策略，對雞蛋清磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析；在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法對鑒定到的雞蛋清磷酸化位點的基序特征、磷酸化蛋白質(zhì)的功能等進(jìn)行分析，旨在為雞蛋清蛋白質(zhì)的相關(guān)研究提供關(guān)鍵的蛋白質(zhì)磷酸化修飾結(jié)構(gòu)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘白來航’雞蛋由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽研究中心農(nóng)場提供，蛋雞品種為‘白來航’，30～50 周齡，籠養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼喂；雞蛋產(chǎn)后24 h內(nèi)進(jìn)行采樣，每次取7 個雞蛋的蛋清進(jìn)行混合，樣品經(jīng)液氮快速凍結(jié)后置于-80 ℃保存；重復(fù)取樣3 次。

胰蛋白酶（質(zhì)譜純） 美國Promega公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher Chemical公司；甲酸（色譜純）美國Fluka公司；碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素（均為生化試劑）、三氟乙酸（分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；蛋白酶抑制劑 德國Calbiochem公司；BCA蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IMAC色譜柱 美國Bio-Rad公司；C18ZipTips脫鹽色譜柱 美國Millipore公司；EASY-nLC 1000型超高效LC、Q Exactive HF-X型MS 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 雞蛋清總蛋白提取與酶解

將雞蛋清樣品從-80 ℃取出，加入4 倍體積酚抽提緩沖液（含0.01 mol/L二硫蘇糖醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蛋白酶抑制劑、1%磷酸酶抑制劑），混勻后進(jìn)行超聲抽提。加入等體積Tris平衡酚，在4 ℃、5 500×g離心10 min，取上清液加入5 倍體積0.1 mol/L乙酸銨/甲醇過夜。離心取蛋白沉淀，用丙酮洗滌3 次，最終沉淀復(fù)溶于8 mol/L尿素中。通過BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白質(zhì)量濃度?？偟鞍滋崛≈貜?fù)3 次，樣品合并后進(jìn)行后續(xù)操作。

向雞蛋清總蛋白提取溶液中加入二硫蘇糖醇使其終濃度為5 mmol/L，于56 ℃還原30 min。加入碘代乙酰胺使其終濃度為0.01 mol/L，室溫避光孵育15 min；將樣品溶液的尿素濃度稀釋至低于2 mol/L，然后以胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，于37 ℃酶解過夜；再以胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比1∶100加入胰蛋白酶，二次酶解4 h。

1.3.2 雞蛋清磷酸肽的親和富集

將酶解后的肽段溶解于富集緩沖溶液（體積分?jǐn)?shù)50%乙腈、6%三氟乙酸）中，并將上清液注入IMAC填料中，在旋轉(zhuǎn)搖床上孵育1 h；用富集緩沖溶液洗滌IMAC填料3 次，除去未結(jié)合的非磷酸化多肽；使用體積分?jǐn)?shù)10%氨水洗脫IMAC填料上結(jié)合的磷酸肽。收集洗脫液并用C18ZipTips柱脫鹽，樣品真空冷凍干燥后用于nLC-MS/MS分析。

1.3.3 nLC-MS/MS分析

富集后的蛋清磷酸肽樣品用流動相A（含體積分?jǐn)?shù)2%乙腈、0.1%甲酸的溶液）溶解后使用EASY-nLC 1000超高效LC系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動相B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸和90%乙腈的溶液，梯度洗脫程序為：0～40 min，5%～25%（體積分?jǐn)?shù)，下同）流動相B；40～52 min，25%～36%流動相B；52～56 min，36%～80%流動相B；56～60 min，80%流動相B。流速為700 nL/min。

將分離后的蛋清磷酸肽注入納噴電離源進(jìn)行電離，然后用Q Exactive HF-X型MS進(jìn)行分析。MS參數(shù)：離子源電壓為2.0 kV；掃描范圍為m/z 350～1 550，MS掃描分辨率為60 000，MS/MS掃描分辨率為30 000；數(shù)據(jù)采集模式為數(shù)據(jù)依賴型掃描，即在MS掃描后選擇信號強度前20 位的肽段母離子，依次進(jìn)行MS/MS分析；MS/MS裂解方式為高能碰撞裂解，碰撞能量為35%；MS/MS掃描的動態(tài)排除時間為15 s。實驗流程如圖1所示。

1.3.4 數(shù)據(jù)庫搜索和生物信息學(xué)分析

MS數(shù)據(jù)使用Maxquant 1.5.2.8軟件進(jìn)行處理和數(shù)據(jù)庫檢索，數(shù)據(jù)庫為UniProt Gallus gallus（29 480 條蛋白質(zhì)序列）。檢索參數(shù)：酶切方式設(shè)置為Trypsin/P，漏切位點數(shù)設(shè)為2；肽段最小長度設(shè)置為7 個氨基酸殘基，肽段最大修飾數(shù)設(shè)為5；初次檢索和主檢索的一級母離子質(zhì)量誤差容忍度分別設(shè)為20×10-6和5×10-6，二級碎片離子質(zhì)量誤差容忍度為0.02 Da；半胱氨酸烷基化設(shè)置為固定修飾，可變修飾包括甲硫氨酸的氧化、蛋白N端的乙?；?，以及酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化；蛋白鑒定、磷酸化修飾鑒定的偽發(fā)現(xiàn)率設(shè)置為1%。

通過Web-Logo在線工具（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）對磷酸化修飾位點序列進(jìn)行統(tǒng)計分析和可視化；基于UniProt基因注釋數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/GOA），對鑒定到的雞蛋清磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體分析；利用IBS在線工具（http：//ibs.biocuckoo.org/）對鑒定到的主要蛋清蛋白質(zhì)磷酸化修飾位點進(jìn)行標(biāo)注和可視化展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋清蛋白質(zhì)的磷酸化修飾位點

由于雞蛋清中磷酸化修飾蛋白質(zhì)的豐度相對較低，為提高M(jìn)S鑒定的豐度和精度，本研究首先通過IMAC材料對雞蛋清磷酸肽進(jìn)行親和富集，再將富集到的磷酸肽進(jìn)行nLC-MS/MS鑒定?；贛S數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)庫檢索，共匹配到285 個多肽，除去未磷酸化多肽和重復(fù)序列，共鑒定到33 個磷酸化修飾多肽。如圖2A所示，所有被鑒定出的磷酸肽均具有較高的精度，其質(zhì)量誤差均小于5×10-6。鑒定到的磷酸肽包含41 個磷酸化修飾位點，歸屬于25 個雞蛋清蛋白質(zhì)（表1）。對鑒定到的磷酸化位點進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，蛋清磷酸化修飾主要發(fā)生在絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和酪氨酸（Y）殘基上，位點數(shù)量分別為38、2 個和1 個。進(jìn)一步通過Web-Logo在線工具對修飾位點附近的序列特征進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，基序“S-X-E”出現(xiàn)頻率最高，其次為“S-X-[S/Y/G]”（圖2B）。與其他畜產(chǎn)品磷酸化蛋白質(zhì)組研究結(jié)果相比，不同物種樣品中磷酸化修飾位點的序列特征具有較大差異，如“S-X-E”基序在豬肉的磷酸化修飾位點中較少見[13-14]。

圖2 雞蛋清磷酸化修飾多肽的質(zhì)量誤差分布（A）和磷酸化修飾序列特征（B）Fig. 2 Mass error distribution of identified CEW phosphorylated peptides (A) and phosphorylation sequence characteristics (B)

表1 鑒定到的雞蛋清磷酸化蛋白和磷酸化修飾位點Table 1 Summary of the identified phosphoproteins and phosphorylation sites in CEW

2.2 磷酸化雞蛋清蛋白質(zhì)的基因本體功能分析

將鑒定到的雞蛋清磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體功能注釋分析，結(jié)果如表2所示。在“分子功能”分類中，有13 個雞蛋清磷酸化蛋白質(zhì)具有“結(jié)合”功能，主要包括“離子結(jié)合”（11 個）、“蛋白質(zhì)結(jié)合”（5 個）、“小分子結(jié)合”（5 個）。表明雞蛋清磷酸化蛋白具有多種結(jié)合能力，暗示這些蛋白質(zhì)在雞胚發(fā)育營養(yǎng)遞送方面具有重要作用，在功能性食品開發(fā)等領(lǐng)域具有潛在開發(fā)價值。有5 個雞蛋清磷酸化蛋白質(zhì)被注釋為具有“分子功能調(diào)控”作用，其主要與內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞因子和神經(jīng)肽激素受體活性等的調(diào)控相關(guān)。有4 個蛋清磷酸化蛋白質(zhì)具有“催化活性”，涉及磷酸基團轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶和蛋白質(zhì)水解酶。

表2 雞蛋清磷酸化蛋白質(zhì)的基因本體功能分析結(jié)果Table 2 Gene ontology analysis of identified CEW phosphoproteins

在“細(xì)胞組分”分類中，有10 個蛋清磷酸化蛋白質(zhì)被注釋為“細(xì)胞外區(qū)域部分”。蛋清蛋白質(zhì)是由輸卵管膨大部細(xì)胞合成和分泌的[15]，因此，大多數(shù)屬于細(xì)胞外蛋白。此外，7 個蛋清磷酸化蛋白質(zhì)被注釋為“細(xì)胞組分”、5 個為“細(xì)胞器”、4 個為“膜組分”。

在“生物過程”分類中，雞蛋清磷酸化蛋白質(zhì)主要參與“生物調(diào)節(jié)”、“應(yīng)激響應(yīng)”、“發(fā)育過程”、“細(xì)胞過程”、“轉(zhuǎn)運”和“免疫響應(yīng)”。其中，應(yīng)激響應(yīng)和免疫響應(yīng)主要包括“體液抗菌反應(yīng)”和“外界生物刺激響應(yīng)”，表明雞蛋清磷酸化蛋白在蛋清抗菌中發(fā)揮著重要作用。

2.3 雞蛋清的主要磷酸化修飾蛋白質(zhì)

圖3 雞蛋清中7 種重要的磷酸化修飾蛋白質(zhì)及其位點分布Fig. 3 Seven important phosphorylated proteins and distribution of their phosphorylation sites in CEW

在鑒定到的25 個雞蛋清磷酸化蛋白中，卵白蛋白具有4 個磷酸化修飾位點，是磷酸化位點最多的蛋白質(zhì)。多數(shù)（17 個）蛋清磷酸化蛋白質(zhì)具有單個磷酸化位點（表1）。以下選擇7 種在雞蛋清中含量較高或具有重要功能的磷酸化蛋白質(zhì)，對其磷酸化修飾位點進(jìn)行可視化展示（圖3），并對磷酸化修飾對該蛋白質(zhì)功能的潛在影響分別進(jìn)行討論。

2.3.1 卵白蛋白

卵白蛋白是雞蛋清中含量最高（約占54%）的蛋白質(zhì)，具有良好的凝膠性、起泡性和乳化性。卵白蛋白在雞蛋中的生物學(xué)作用至今尚不完全清楚，有學(xué)者認(rèn)為其主要作為胚胎發(fā)育的營養(yǎng)來源[16]。研究顯示，卵白蛋白磷酸化改性會增強其乳化性和溶解度，并能增加其與鈣的結(jié)合能力，形成蛋白螯合鈣，有利于鈣的吸收[17-18]，說明卵白蛋白的磷酸化修飾對其功能特性和生物活性具有重要作用。

本研究共鑒定到卵白蛋白的4 個磷酸化修飾位點，其中S69（SIE）、S345（SAE）是之前研究中已報道的磷酸化修飾位點[19]。這兩個位點所在肽段的MS/MS數(shù)量（該數(shù)值與磷酸化修飾多肽在樣品中的豐度呈正相關(guān)）在所有鑒定到的磷酸肽中最高，分別為151和144，表明這2 個位點所在的磷酸肽豐度最高。卵白蛋白的另外2 個磷酸化修飾位點S3（SIG）和S8（SME）是本研究中新發(fā)現(xiàn)的磷酸化修飾位點，其MS/MS數(shù)量均為1，表明這兩個位點所在磷酸肽的豐度較低。4 個磷酸化修飾位點豐度的差異也證明了卵白蛋白磷酸化修飾的不均一性，即卵白蛋白的S69和S345位點發(fā)生磷酸化修飾的幾率高，而S3和S8位點發(fā)生磷酸化修飾的幾率很低，僅約為前者的1/100。

2.3.2 卵白蛋白相關(guān)蛋白-Y

卵白蛋白相關(guān)蛋白-Y在雞蛋清中的相對含量較低，其與卵白蛋白都屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，但不同于卵白蛋白，卵白蛋白相關(guān)蛋白-Y具有抑制絲氨酸蛋白酶的作用[16]。Nau等通過二維凝膠電泳結(jié)合免疫印跡技術(shù)，尋找卵白蛋白相關(guān)蛋白-Y的磷酸化修飾位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其未發(fā)生磷酸化修飾[20]。然而，本研究共鑒定到該蛋白的3 個磷酸化位點：S5、S68或T69、T70或S72。Qiu Ning等發(fā)現(xiàn)卵白蛋白相關(guān)蛋白-Y在受精雞蛋與未受精雞蛋中的豐度具有顯著差異，認(rèn)為其可能在胚胎發(fā)育中起重要作用[21]。本研究對該蛋白質(zhì)磷酸化修飾位點的鑒定將有助于其生物學(xué)功能的深入研究。

2.3.3 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白約占蛋清總蛋白含量的12%，具有鐵離子結(jié)合能力。在以前的研究報道中，鮮有發(fā)現(xiàn)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白發(fā)生磷酸化修飾。但在相關(guān)研究中，二維凝膠電泳上的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白均顯示為多個蛋白點，表明其具有不同的分子質(zhì)量和等電點，推測其發(fā)生了糖基化或磷酸化等翻譯后修飾。本研究鑒定到卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的一個磷酸化修飾位點（Y543），其MS/MS數(shù)量為1，表明該磷酸化修飾位點的豐度較低，即卵轉(zhuǎn)鐵蛋白在該位點發(fā)生了較低幾率的磷酸化修飾。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的化學(xué)磷酸化修飾改性可增強其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性[7]，而其翻譯后修飾過程中發(fā)生的低頻率、單位點磷酸化修飾在其分子功能中的作用需待進(jìn)一步研究。

2.3.4 半胱氨酸蛋白酶抑制劑

早期研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有磷酸化修飾和未磷酸化修飾兩種形式，部分蛋白的S103位點發(fā)生了磷酸化修飾，改變了其表面電荷性質(zhì)，等電點由6.5降至5.6[22]。本研究再次證實了半胱氨酸蛋白酶抑制劑位于該位點的磷酸化修飾。磷酸化修飾雖不影響半胱氨酸蛋白酶抑制劑的抑制活性[22]，但研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育過程中，磷酸化修飾參與調(diào)控其從蛋清到卵黃囊的轉(zhuǎn)運過程[23]。

2.3.5 核黃素結(jié)合蛋白

核黃素結(jié)合蛋白是在雞蛋清、雞蛋黃以及雞血清中均存在的蛋白質(zhì)，其分子中具有兩個相對獨立的功能域：核黃素結(jié)合區(qū)域和磷酸化區(qū)域。核黃素結(jié)合區(qū)域以1∶1的物質(zhì)的量比與核黃素結(jié)合，在胚胎發(fā)育過程中為其提供足夠的核黃素。磷酸化區(qū)域不參與核黃素的結(jié)合，但參與了核黃素結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)運，并在其與卵黃生成素的相互作用中起到關(guān)鍵作用[24]。文獻(xiàn)[25]報道核黃素結(jié)合蛋白被鑒定出8 個磷酸化位點，但本研究僅鑒定到其中的3 個位點，對其磷酸化修飾結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究將有助于深入了解其功能和轉(zhuǎn)運機制。

2.3.6 Ovocleidin-17

Ovocleidin-17被認(rèn)為是主要的蛋殼基質(zhì)蛋白之一，在蛋清中亦有少量分布。在蛋殼礦化過程中，Ovocleidin-17可能作為鈣離子結(jié)合的初始“錨點”，對蛋殼碳酸鈣晶體的成核和生長具有重要作用[26]。研究顯示，Ovocleidin-17具有2 個磷酸化的絲氨酸位點S61和S67[27]，這兩個磷酸化修飾位點在本研究中亦被鑒定到。Hecker等研究發(fā)現(xiàn)，Ovocleidin-17的磷酸化修飾是其鈣結(jié)合能力的基礎(chǔ)，并推測其酸性氨基酸的羧基和絲氨酸殘基的磷酸基團共同構(gòu)成了鈣離子的結(jié)合位點[28]。

2.3.7 Dickkopf相關(guān)蛋白-3

研究顯示，Dickkopf相關(guān)蛋白-3基因的mRNA在小雞眼睛中高度表達(dá)[29]，說明該基因在胚胎發(fā)育過程中起重要作用。此外，其他動物的相關(guān)研究顯示，Dickkopf相關(guān)蛋白-3有可能在抑制腫瘤增長、分化、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[30]。本研究鑒定出蛋清Dickkopf相關(guān)蛋白-3的1 個磷酸化位點（S286），該位點所在磷酸肽的MS/MS數(shù)量為12，表明該位點所在磷酸肽的豐度較高。磷酸化修飾往往與信號傳遞、蛋白質(zhì)互作等相關(guān)，Dickkopf相關(guān)蛋白-3的磷酸化可能對其功能具有重要的作用。

3 結(jié) 論

本研究對雞蛋清的磷酸化修飾蛋白質(zhì)組進(jìn)行系統(tǒng)分析，共鑒定出25 個雞蛋清磷酸化修飾蛋白質(zhì)和41 個磷酸化修飾位點。分析顯示，雞蛋清蛋白質(zhì)的翻譯后磷酸化修飾發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基上，“S-X-E”為雞蛋清磷酸化修飾位點的主要基序。功能分析表明，雞蛋清磷酸化蛋白質(zhì)主要具有“結(jié)合”功能，主要參與“應(yīng)激響應(yīng)”等生物過程。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究雞蛋清相關(guān)科學(xué)問題提供了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。