膠束電動色譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分離分析中的應用研究進展

高凡 王曉飛 張博

摘?要?膠束電動色譜（MEKC）作為一種兼具色譜和電泳分離機理的方法，既具有準固定相與分析物間的相互作用，又可以利用帶電分子在電場中遷移行為的差異進行分離。MEKC的這些特點在蛋白質(zhì)和多肽這類具有高維度數(shù)的生物分子的分離中得到了很好的體現(xiàn)。無論是單維分離， 還是多維分離，MEKC都顯現(xiàn)出在生物大分子分離方面良好的應用前景。近年來，隨著CE-MS的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了很多新的MEKC-MS聯(lián)用技術(shù)，進一步顯示了MEKC在蛋白質(zhì)與多肽分離分析中的應用前景。本文首先對膠束電動色譜技術(shù)進行了簡介，綜述了近年來膠束電動色譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分離分析中的研究應用進展，并對其發(fā)展前景進行了展望。

關(guān)鍵詞?膠束電動色譜; 表面活性劑; 毛細管電泳; 蛋白質(zhì); 多肽; 質(zhì)譜; 評述

1?引 言

蛋白質(zhì)是由一條或多條肽鏈組成的復雜的生物大分子，是生物體的重要組成物質(zhì)，在生物體內(nèi)參與諸多生理活動。除了肽鏈上數(shù)量龐大的氨基酸序列，蛋白質(zhì)的復雜性還體現(xiàn)在：（1）肽鏈內(nèi)部以及肽鏈之間的折疊，形成不同的空間結(jié)構(gòu); （2）蛋白質(zhì)的分子量和尺寸差異; （3）氨基酸側(cè)鏈基團和結(jié)構(gòu)域?qū)е碌挠H疏水性差異; （4）肽鏈殘基以及側(cè)鏈基團的電離或水解使得蛋白質(zhì)呈現(xiàn)為兩性分子; （5）活性位點不同導致的免疫親和特異性。從分離的角度看，蛋白質(zhì)的多重屬性使得這類分子具有非常大的樣品維度數(shù)[1]，它與分離系統(tǒng)的維度數(shù)相對應，是指能夠確定樣品組成的獨立變量的數(shù)量。這里的獨立變量指的是樣品的不同屬性，即分離可依據(jù)的屬性。樣品維度數(shù)越大，說明分離該樣品可以依據(jù)的屬性就越多，也說明樣品可能的復雜性，當樣品維度數(shù)大于分離系統(tǒng)維度數(shù)時，可能導致組分峰的無序分布，即無法完全分離; 當樣品維度小于分離系統(tǒng)維度數(shù)時，通過多維分離系統(tǒng)所獲得的高峰容量無法充分利用，會造成分離能力的浪費。蛋白質(zhì)的高樣品維度數(shù)為蛋白質(zhì)的分離分析提供了多種可利用的屬性（不同的單維分離方法）以及高峰容量分離方法的建立（多維分離方法）。蛋白質(zhì)的每一種屬性都能夠?qū)辽僖环N分離方法，如分子量和分子尺寸可以作為尺寸排阻色譜或者凝膠電泳的依據(jù)， 疏水性不同可以通過反相色譜達到分離目的，帶電量與分子量的關(guān)系可用于電泳分離，等電聚焦則利用了等電點和兩性分子的特點，而免疫親和色譜利用了蛋白質(zhì)的免疫特異性。

膠束電動色譜（Micellar electrokinetic chromatography，MEKC）作為一種特殊的電泳模式，與上面提到的分離方法不同。蛋白質(zhì)在MEKC中的分離是由蛋白質(zhì)的電泳淌度以及蛋白質(zhì)分子與膠束準固定相的相互作用共同決定。Terabe等[2]對MEKC 給出的定義是： MEKC是一種基于可遷移非固態(tài)分離介質(zhì)的電遷移分離技術(shù)。電動色譜儀器與毛細管電泳儀器基本一致，不同之處是需要向緩沖溶液中加入表面活性劑，當其濃度大于臨界膠束濃度時，通常是50～100個表面活性劑分子的疏水基團聚集到一起，親水端向外，形成膠束。以膠束作為準固定相的電動色譜即為膠束電動色譜。MEKC具有兩個特點[3]：沒有靜止的固定相，這種準固定相同樣會在分離通道中遷移; MEKC是色譜與電泳機理相結(jié)合的分離模式。膠束與電解質(zhì)溶液有不同的遷移性質(zhì)，中性物質(zhì)的分離是基于分析物在膠束和溶液中的分配系數(shù)不同而獲得，而對于帶電物質(zhì)，分離機理則是基于分析物在兩相中分配系數(shù)的不同， 以及它們在電場下電遷移的差異[4]。

由于MEKC的雙重分離機理，電中性分子在MEKC體系中的樣品維度數(shù)小于分離體系的維度數(shù)，無法充分分離。而蛋白質(zhì)既具有較高的電荷密度，且蛋白質(zhì)分子之間存在親疏水差異。因此，對于蛋白質(zhì)樣品，MEKC可以充分體現(xiàn)出其出色的分離能力（圖1）。

2?單維膠束電動色譜

2.1?表面活性劑的影響與調(diào)控

選擇不同的緩沖溶液中表面活性劑和添加劑，是調(diào)控MEKC對蛋白質(zhì)分離效果的最直接方法。表面活性劑在緩沖液中形成膠束，充當了準固定相的角色，對樣品提供色譜保留性。作為最常用的表面活性劑，十二烷基硫酸鈉（SDS）在MEKC蛋白質(zhì)分離中應用廣泛。SDS由疏水的長烷基鏈和親水的SO24組成。當大分子量蛋白質(zhì)加入緩沖液中時，大量的SDS分子會嵌入或吸附在變性的蛋白質(zhì)分子上[5]，色譜保留主要通過蛋白質(zhì)表面與膠束之間產(chǎn)生的相互作用實現(xiàn)。Lamb等[6]利用MEKC對一系列糖蛋白疫苗及其載體蛋白進行分離，發(fā)現(xiàn)提高硼酸鹽濃度有助于實現(xiàn)基線分離，而SDS濃度由25 mmol/L提高到50 mmol/L， 對白喉類毒素（Dt）和腦膜炎球菌多糖A型-白喉類毒素配合物（MnA-Dt）的分離效果并未明顯提高。這一研究將MEKC直接用于臨床樣品檢驗，符合臨床檢測快速、低消耗的特點和要求。與大分子蛋白質(zhì)不同，肽類分子由于體積小，一般可以自由進出膠束內(nèi)部而表現(xiàn)出不同的色譜保留性。MEKC在分離小分子多肽時常會表現(xiàn)出非常好的分離效果。腦啡肽是一種小分子神經(jīng)遞質(zhì)，一般由5個氨基酸殘基組成。Huang等[7]基于高靈敏LIF檢測，通過MEKC分離8種腦啡肽類多肽，考察了不同SDS濃度下各物質(zhì)的基線分離情況以及不同緩沖液pH條件下各種肽類似物的出峰時間變化。Wu等[8]用MEKC分離了氨基酸種類、數(shù)量相同，但序列不同的三肽，在優(yōu)化的pH條件下實現(xiàn)了這些細小結(jié)構(gòu)差異小肽的基線分離。

利用MEKC分離蛋白質(zhì)這類生物大分子時，SDS通常會嵌入到蛋白質(zhì)內(nèi)，由于結(jié)合表面活性劑數(shù)量不同， 會出現(xiàn)同一蛋白的多重峰現(xiàn)象。Cooper等[9]對一個單克隆抗體進行構(gòu)象分析，發(fā)現(xiàn)該單克隆抗體在電泳圖中分裂成多個峰，分析表明是由于嵌入的SDS數(shù)量不同所導致的，而當SDS濃度遠大于臨界膠束濃度時，這一現(xiàn)象變得不明顯。

在以SDS為表面活性劑對蛋白質(zhì)分離的MEKC研究中，研究者開發(fā)了很多方法，如毛細管內(nèi)壁涂覆、pH值影響探究、超高溫分離，進樣方式以及分離載體的開發(fā)應用等。在用CZE分離蛋白質(zhì)時，一個非常重要的問題是蛋白質(zhì)（尤其是大分子量的）在毛細管內(nèi)壁的吸附。而MEKC由于有表面活性劑的存在，表面活性劑一般會鋪滿內(nèi)壁，充當一個動態(tài)的涂層，減少蛋白質(zhì)的吸附[10]。這一優(yōu)點使得MEKC可用于分離性質(zhì)差異微小的大分子蛋白。人轉(zhuǎn)鐵蛋白是轉(zhuǎn)運Fe3+必不可少的大蛋白，Nowak等[11]用甲醇作為有機添加劑修飾的MEKC分離了根據(jù)Fe3+失去數(shù)目劃分的4種形式的轉(zhuǎn)鐵蛋白（圖2）。而由于Fe3+取代的是分子上的H+，所以并未改變蛋白質(zhì)的帶電性，這體現(xiàn)了MEKC在分離細小差異的蛋白質(zhì)上具有非常優(yōu)越的性能。Kats等[12]利用MEKC監(jiān)測了單克隆抗體在pH 2～12條件下的異構(gòu)體轉(zhuǎn)換，在不同pH條件下能夠分離出1～5個信號峰，揭示了pH值對抗體構(gòu)型的影響。Djordjevic等[13]對MEKC的超高溫模式下的分離效果進行了考察，考察溫度范圍15～115℃，發(fā)現(xiàn)塔板數(shù)與分離時間的比值隨溫度升高而增大，但是分離效率先隨溫度升高，在60℃左右驟降，之后繼續(xù)升高。這里，導致塔板數(shù)-分離時間的比值隨溫度升高的原因可能有多種，如減少管壁的作用（吸附和解吸動力學狀態(tài)）、膠束微環(huán)境的一致性增加、溶質(zhì)構(gòu)象快速變化以及增快傳質(zhì)效率等。然而，溫度升高時， 臨界膠束濃度增大，柱溫升高導致的柱外效應引起的峰展寬，以及高溫下膠束發(fā)生重組都可能導致分離效果的下降。

2.2?表面活性劑的種類

MEKC中使用的表面活性劑有很多種，如陰離子表面活性劑（如SDS）、陽離子表面活性劑（如CTAB）、兩性離子表面活性劑（如CHAPS）、非離子型表面活性劑（如Brij35），以及針對MEKC技術(shù)引入的聚合物表面活性劑[21]、可揮發(fā)性表面活性劑（PFOA）[22～24]，離子液體[25，26]，甚至一定大小的納米粒子也可以視為表面活性劑形成的膠束[27]。不同的表面活性劑有不同的帶電性和結(jié)構(gòu)，形成膠束的保留性不同，適合分離不同的蛋白質(zhì)。不同蛋白質(zhì)與多肽之間的差異可能很大，需選用適當?shù)谋砻婊钚詣┮缘玫嚼硐氲姆蛛x結(jié)果，例如強啡肽類多肽的pI≈10，在常用的緩沖液中均以正離子形式存在，如選用SDS作為表面活性劑，由于SDS是陰離子表面活性劑，離子對現(xiàn)象會非常嚴重。針對強啡肽及其類似物，F(xiàn)urtos-Matei等[28]對多種類型的表面活性劑進行了考察，使用陽離子表面活性劑CTAB可以從13種物質(zhì)中獲得12個色譜峰，其中兩種物質(zhì)會有共洗脫現(xiàn)象，而使用兩性表面活性劑CHAPS可以完全分離13種物質(zhì)（圖3）。Lupi等[29]在分離幾種結(jié)構(gòu)相近的多肽時，戊酸和SDS均無法實現(xiàn)基線分離，膽酸鈉可以獲得 良好的分離效果，而非離子型表面活性劑Brij35能達到最好的分離效果。

單一的表面活性劑達到的分離效果經(jīng)常不理想，與其它類型的表面活性劑混合后， 常能獲得更好的分離效果。 Haunschmidt等[30]用SDS和脫氧膽酸鹽混合作為表面活性劑，成功基線分離了單一表面活性劑所不能很好分離的胰島素和人工合成胰島素類似物，并且結(jié)果優(yōu)于CZE和MEKC。不同的混合膠束體系通常有對應的混合膠束機理。Kang等[31]通過對桿菌肽的分離，研究了MEKC中混合膠束機理，先是選出有最優(yōu)選擇性的兩性表面活性劑PAPS，然后將非離子型表面活性劑Brij35加入緩沖液中，解決了使用單一表面活性劑時的峰拖尾的現(xiàn)象。研究者認為，在這一體系中，Brij35合并到PAPS形成的膠束中形成新的膠束，改變了原膠束的空間結(jié)構(gòu)，Brij35的聚氧化乙烯鏈屏蔽了PAPS的離子基團，減弱了膠束與分析物直接的靜電作用，同時Brij35的加入增加了緩沖液的粘度，延長了遷移時間，增長了分離窗口，提高了柱效。

2.3?其它添加劑

環(huán)糊精及其衍生物有廣泛的選擇性，是MEKC中最常用的手性拆分試劑。環(huán)糊精衍生物的溶解性通常優(yōu)于環(huán)糊精[32]。作為一種手性添加劑，環(huán)糊精要結(jié)合到緩沖液中的膠束中才能發(fā)揮手性拆分的作用，多見于修飾以SDS為表面活性劑的MEKC中，對具有手性中心的多肽分離效果良好。Donges等[33]利用β-環(huán)糊精和有機溶劑改性的SDS-MEKC分離抗凝血酶III的α和β異構(gòu)體， Chen等[34]利用2-羥丙基-β-環(huán)糊精成功分離了帶有兩個手性中心的二肽。

離子液體是一類熔點在100℃以下的熔融鹽[25]，具有良好的水溶性和高導電性，可以作為電解質(zhì)或緩沖液的添加劑，其中，短鏈的離子液體具有表面活性劑的性能。Xu等[26]將功能化的離子液體（BDS）作為MEKC的電解質(zhì)鹽和表面活性劑應用在PDMS芯片上，獲得了較好的通道內(nèi)壁動態(tài)涂覆效果，避免了樣品吸附，并且不影響熒光試劑的靈敏度，在分離熒光試劑以及熒光標記的蛋白質(zhì)時獲得了比其它表面活性劑更高的分辨率。

2.4?MEKC靈敏度

靈敏度是電泳模式（尤其是紫外檢測）的主要影響因素，電泳的低進樣量和柱容量都在一定程度上制約著紫外檢測器的使用。針對靈敏度的問題，研究者開發(fā)了多種柱上預濃縮/進樣技術(shù)，如場放大堆積[14]、大體積上樣堆積[15]、動態(tài)pH界面[16]和等速電泳[17，18]等。場放大進樣是基于背景電解液和樣品溶液的導電性不同，在進樣時對樣品進行富集，Wu等[19]利用該技術(shù)對人尿液中的白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白進行進樣富集和分離，富集倍數(shù)高，且沒有分離效率損失。多種進樣方式結(jié)合使用，可提高進樣量和預濃縮效果， Furmaniak等[20]結(jié)合了場放大進樣技術(shù)和吹掃技術(shù)，對人尿液中同型半胱氨酸硫內(nèi)酯進行了進樣濃縮。

3?二維分離中的膠束電動色譜

3.1?二維分離的優(yōu)勢與特點

單維分離方法的峰容量有限，對于蛋白質(zhì)/多肽這類復雜的生物分子，需要更高分辨率的分離技術(shù)。Giddings提出構(gòu)建多維分離系統(tǒng)的兩個準則[1]：維度之間必須正交; 后一維度的分離不能損失前一維度已獲得的分辨率。當滿足以上兩個準則時，多維分離方法的峰容量等于各個維度峰容量的簡單乘積。因此，多維分離方法非常適合分離蛋白質(zhì)/多肽這類高維度數(shù)的分子。MEKC作為一種同時兼具電泳特性和色譜特性的分離方法，在蛋白質(zhì)/多肽的分離分析中可以與多種電泳模式構(gòu)建二維分離體系。

在二維分離平臺的構(gòu)建中（圖4），維度間的聯(lián)用非常重要，直接影響到樣品的轉(zhuǎn)移和分離效果的保持。二維聯(lián)用的方式有離線聯(lián)用和在線聯(lián)用兩種，離線方法經(jīng)常會由于液槽吸附而產(chǎn)生樣品損失，人工樣品轉(zhuǎn)移導致重現(xiàn)性差，第二維進樣體積大而損失分離效率等問題; 相比之下，在線聯(lián)用技術(shù)省卻了人工操作，避免了樣品損失，且分析的重現(xiàn)性也得到顯著改善。針對蛋白質(zhì)分離的2D-CE平臺，在線聯(lián)用通常要做到樣品低損耗、無交叉污染、連續(xù)進樣并避免樣品擴散、保持電連接， 甚至可更換緩沖液等。

3.2?基于芯片的二維平臺

Ramsey等[35]首次在玻璃芯片上構(gòu)建MEKC分離蛋白質(zhì)的二維平臺，通過控制緩沖液槽的電勢與樣品槽的電勢，在交叉通道處調(diào)控液流的方向，從而實現(xiàn)定向脈沖進樣，展示了以芯片為基礎的MEKC與CZE的聯(lián)用方式。然而，進入第二維的樣品量僅約占進入第一維樣品量的10%，造成了樣品分析的不完全。如果在第一維采用分離速度更慢的模式或保證分離后樣品擴散緩慢，第二維依然使用快速分離（如MEKC等），就可以在一定程度上減小樣品損失。Shadpour等[36]在PMMA芯片上以SDS-CGE作為第一維分離; 第二維采用很短的分離通道進行快速MEKC分離，獲得了的峰容量>1000。在該方法中，同樣是通過流路的方向調(diào)控脈沖式的維度間進樣。與文獻[35]不同的是，該方法第一維度是SDS-CGE，進樣時第一維的分離通道中電場是反向的，只有進入十字交叉區(qū)域的第一維流出物才會被第二維分離。這樣減小了樣品損失，又避免了在十字交叉區(qū)域處可能產(chǎn)生樣品的返混現(xiàn)象。該方法聯(lián)用成功的原因之一是毛細管凝膠電泳可以在一定程度上抑制樣品的擴散，為脈沖進樣提供時間。此后，該研究組[37]增加了分離通道的長度，以獲得更大的峰容量。

3.3?基于毛細管的二維平臺

電泳分離的最成熟載體是毛細管，很多文獻報道了以毛細管為分離通道的MEKC二維電泳平臺的研究。Dovichi的研究組[39]構(gòu)建了基于毛細管的CSE-MEKC分離平臺，對很多實際樣品如病變組織[38]和單個哺乳動物細胞的蛋白質(zhì)指紋譜測定，效果良好。在此平臺中，作者通過將兩根毛細管對接并置于第二維緩沖液槽中，既達到維度間樣品傳遞目的，又成功替換了第一維中的緩沖液。為了提高通量，還建立了5道并行的CSE-MEKC平臺[40]。然而，CSE-MEKC平臺的峰容量不高，原因在于第一維的分離時間過長導致的樣品擴散、 維度間樣品轉(zhuǎn)移導致的區(qū)帶展寬以及第二維MEKC過短的分離時間。Sheng等[41]開發(fā)了一個帶有中空纖維膜的十通閥用以聯(lián)用MEKC-IEF分離蛋白質(zhì)。中空纖維膜的作用是更換第一維緩沖液，十通閥的使用滿足了維度間非連續(xù)進樣，因為第二維的等電聚焦有區(qū)帶聚焦效果，減小了由于第一維的樣品擴散導致的峰展寬。Yang等[42]也利用中空纖維膜對2D-CE的接口開展了研究，由于特殊的多孔性，中空纖維膜理論上很適合作為二維電泳的接口。但是，中空纖維膜對蛋白質(zhì)具有一定的吸附作用。 另外， 由于作為接口的膜內(nèi)壁不帶電荷，不會形成雙電層結(jié)構(gòu)，這一段的液流驅(qū)動屬于力學驅(qū)動，即拋物線形液流，會產(chǎn)生峰展寬。

4?膠束電動色譜與質(zhì)譜聯(lián)用

4.1?MEKC-ESI-MS聯(lián)用技術(shù)

質(zhì)譜能夠提供豐富的分子量信息用于蛋白/多肽鑒定，已成為蛋白/多肽分析中最常用的檢測方式，電噴霧離子源（ESI）具有軟電離特性，因此成為液相分離最常用的質(zhì)譜檢測器。組成MEKC準固定相的表面活性劑是引起MEKC與質(zhì)譜兼容性差的最主要因素。為了克服這一缺點，實現(xiàn)MEKC-MS高效聯(lián)用，目前的解決方案有兩種[43]：第一種是避免將準固定相引入質(zhì)譜系統(tǒng)，包括毛細管部分充滿法[44]、準固定相反向遷移法[45]和準固定相去除法[46]等; 第二種是將準固定相引入質(zhì)譜，例如易揮發(fā)性表面活性劑[22，24，47]、高聚物表面活性劑[21，48]等。

4.1.1?毛細管部分充滿法?Nelson等[49]和Koezuka等[50]基于準固定相的遷移速率通常要小于電滲流以及分析物遷移速率的原理，在傳統(tǒng)MEKC基礎上，建立了毛細管部分充滿法（PF-）MEKC。在PF-MEKC中，毛細管的第一部分充入含有準固定相的背景電解液，樣品主要在這一區(qū)域發(fā)生分離。其余部分充入不含有準固定相的質(zhì)譜友好的背景電解液（如醋酸銨緩沖溶液），供樣品分離后進入，在膠束抵達離子源前停止分離，從而避免膠束進入離子源。Koezuka等[50]在PF-MEKC中使用了在酸性條件下遷移速率非常低的非離子型表面活性劑，分離鑒定了神經(jīng)降壓素和血管緊張素的類似物。然而，膠束緩沖邊界處會產(chǎn)生樣品的區(qū)帶展寬，檢測窗口的長短由表面活性劑的有效淌度決定， 而非膠束的有效淌度決定，總分離體積減小，這些都是PF-MEKC的不足之處。

4.1.2?準固定相去除?準固定相反向遷移是避免膠束進入離子源的另一種方法。Yang等[51]通過調(diào)節(jié)背景電解液至pH 5.9，使電滲流的遷移速率略小于SDS膠束的正極遷移速率，避免了膠束進入離子源，并且增長了分離窗口，提高了分辨率。準固定相正極遷移的方法適用帶正電物質(zhì)和在準固定相中的保留性不強的中性物質(zhì)，但是對于帶負電的物質(zhì)，遷移速度的方向并不一定能夠指向出口[52]。準固定相去除是很早就使用的一種與質(zhì)譜聯(lián)用的方法，這一操作類似于二維電泳中以MEKC作為第一維分離方法，在接口處進行背景電解液的替換。例如，Lamoree等[53]設計的聯(lián)用兩根毛細管來進行電壓切換和緩沖液的更新，在MEKC分離后的分析物由CZE進入質(zhì)譜。此外，Kinde等[54]設計了一個聯(lián)用MEKC-MS的芯片裝置，利用自由流區(qū)帶電泳連續(xù)萃取低分子量的陽離子分析物，當使用涂層試劑抑制電滲流后，高效萃取出兩種多肽。該工作也為MEKC-MS分離鑒定蛋白多肽提供了思路，即設計一個能夠不斷將蛋白/多肽萃取至無表面活性劑的緩沖液中，且盡可能保留分離效果的裝置。但是，由于準固定相的去除需要進行緩沖液的更換，所以在接口處難免會存在區(qū)帶展寬， 甚至樣品損失的問題。

4.1.3?質(zhì)譜兼容型表面活性劑?能夠直接聯(lián)用MEKC-ESI-MS的表面活性劑的開發(fā)一直是研究的重點。其中，半揮發(fā)性的表面活性劑（如全氟辛酸銨）以及聚合物表面活性劑的研究尤其關(guān)鍵。Ishihama等[47]首次將全氟辛酸作為MEKC的表面活性劑，利用其較強揮發(fā)性的特點，與質(zhì)譜聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)在低濃度下僅存在有限的離子化抑制現(xiàn)象。之后，Petersson等[55]將PFOA的濃度提升到100 mol/L進行了MEKC-MS實驗，結(jié)果表明，離子化抑制并不嚴重。鑒于PFOA的這個特性，很多研究者進行了MEKC-MS聯(lián)用的研究[23，24]。雖然質(zhì)譜對PFOA有一定的耐受性，并不能完全適應。Ortner等[56]以PFOA作為表面活性劑，采用MEKC-MS對幾種胰島素類似物進行了分離鑒定，發(fā)現(xiàn)PFOA并不能顯著降低離子化抑制效應。Vieira等[57]通過實驗證實了背景電解質(zhì)中，兩倍于SDS濃度的全氟辛酸銨會引起50%的離子化抑制。雖然半揮發(fā)性表面活性劑仍然存在局限性，但仍是生物大分子MEKC-MS分析中的重要選擇。

4.2?MEKC-DESI-MS與MEKC-DART-MS聯(lián)用技術(shù)

解吸電噴霧離子源（DESI）可以直接檢測未經(jīng)處理的樣品，具有很高的鹽耐受性[58]。在2%（w/w）鹽濃度存在下， 102 ng/mL濃度水平的分析物也可以被檢測到[59]。Myung等[60]提出了DESI對蛋白質(zhì)等生物大分子的特殊離子化機理，認為DESI是一種比ESI更軟的離子源。Shin等[61]發(fā)現(xiàn)，隨著分子量增加，DESI的信噪比降低，其對于分子量一般不超過17 kDa的整體蛋白具有較好鑒定效果。Zare課題組[62]用旋轉(zhuǎn)噴霧盤在對前端MEKC、CE的流出物點板的同時，已經(jīng)點好的樣品點會旋轉(zhuǎn)至DESI離子源被解吸離子化。然而，DESI對MEKC和MS聯(lián)用以及對蛋白質(zhì)分析具有一定的局限性。由于解吸離子化的方式導致DESI的離子化效率比較低，并且會存在一定的樣品損失，可能出現(xiàn)生物體系中低豐度蛋白無法檢測和重現(xiàn)性差等問題。隨著常壓離子源的廣泛應用，研究者開發(fā)了實時直接分析（DART）質(zhì)譜[63]。Chang等[64]利用在共軸針尖接口基礎上設計了DART的離子化方法，考察了CE-DART-MS對難揮發(fā)鹽和表面活性劑的耐受性，發(fā)現(xiàn)SDS和硼酸鈉的使用相對于純水溶液并沒有產(chǎn)生離子化抑制。并且，當使用濃度高達50 mol/L的SDS和硼酸鈉時，離子峰的信號強度也可達到原強度的75%。在此基礎上，該課題組進行了MEKC-DART-MS實驗，得到了良好的檢測限和重現(xiàn)性。DART對鹽和表面活性劑的耐受性良好， 在MEKC-MS分離檢測蛋白/多肽方面具有巨大的潛力。

4.3?MEKC-APCI-MS與MEKC-APPI-MS聯(lián)用技術(shù)

能夠與MEKC聯(lián)用的大氣壓離子源還包括大氣壓化學電離源（APCI）和大氣壓光電離源（APPI）。Takada等[65]的研究證明了MEKC-APCI-MS的可行性，顯示了APCI對高濃度鹽和表面活性劑具有優(yōu)于ESI的耐受性。雖然APCI與MEKC的兼容性好，但對蛋白質(zhì)的檢測靈敏度并不高，這主要是由于APCI對蛋白質(zhì)這一類極性較強的大分子的離子化效率不佳，這也限制了APCI在實際生物樣品中的應用。Mol等[66]將APPI離子源引入MEKC-MS中，分離檢測了多種中性小分子，顯示了APPI在鹽和表面活性劑存在條件下對弱極性小分子鑒定的優(yōu)越性。He等[67]基于MEKC-APPI-MS平臺，利用混合分子膠束實現(xiàn)了安息香衍生物的手性分離與鑒定。雖然APCI和APPI對蛋白質(zhì)等大分子的鑒定能力較弱，但作為MEKC-MS聯(lián)用的軟離子源，對于弱極性小分子的分離分析已成為ESI的有力補充。

5?總結(jié)與展望

MEKC結(jié)合了色譜和電泳技術(shù)的優(yōu)點，在蛋白/多肽的分離中具有極大的應用潛力。通過對MEKC緩沖液組成以及分離介質(zhì)的設計優(yōu)化，充分利用MEKC與其它分離手段的聯(lián)用，能夠獲得優(yōu)良的分離結(jié)果。通過方法優(yōu)化，減少或替代進入質(zhì)譜的表面活性劑，可以在一定程度上解決MEKC-MS聯(lián)用中的問題。質(zhì)譜是蛋白/多肽的分離分析最常用的技術(shù)之一，因此，開發(fā)新型質(zhì)譜兼容型表面活性劑、改善MEKC分離介質(zhì)以及開發(fā)新型CE-MS接口等，是MEKC用于蛋白/多肽分離分析中需要重點研究的內(nèi)容。

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