王可 劉昭華 曹洪防 楚惠民 崔緒奎

摘要：為了解近年來山東省對濟(jì)寧青山羊品種資源保護(hù)效果，采用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)，對山東省境內(nèi)的4個(gè)濟(jì)寧青山羊群體進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳分化分析。結(jié)果顯示：24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在4個(gè)群體135個(gè)個(gè)體中共檢測到159個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)6.6個(gè);4個(gè)群體的PIC在0.6016～0.6653之間，群體的He在0.6750～0.7559之間，但是群體的Ho均低于He，LWQ最低（0.5375），JXQ最高（0.6260）;群體分化系數(shù)（Fst）為0.0774，基因流（Nm）分析表明每世代4個(gè)群體間有效遷移個(gè)體數(shù)為1.8905;遺傳距離和遺傳相似性指數(shù)分析表明，SXQ、HHQ和JXQ群體間具有較近的親緣關(guān)系，而與LWQ群體間遺傳距離相對較遠(yuǎn)。結(jié)果表明：濟(jì)寧青山羊群體遺傳多樣性豐富，群體間存在一定的基因交流，遺傳分化水平較低，但4個(gè)群體都存在不同程度的近交，SXQ和LWQ群體的近交程度較高，所以在實(shí)際工作中，應(yīng)注意擴(kuò)大群體數(shù)量，避免近交衰退。

關(guān)鍵詞：濟(jì)寧青山羊;微衛(wèi)星;資源保護(hù);遺傳多樣性;遺傳分化

中圖分類號：S813.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0129-06

濟(jì)寧青山羊（Jininggreygoat）是山東省優(yōu)良的地方山羊品種，具有性成熟早、多胎多羔、常年發(fā)情、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)良種質(zhì)特性[1]，2006年被列為國家級畜禽遺傳資源保護(hù)品種[2]。近年來，隨著人們對羊肉需求量的日益增加，養(yǎng)羊效益和保種矛盾逐步凸顯，濟(jì)寧青山羊雜交濫交現(xiàn)象和品種資源消耗嚴(yán)重，純種數(shù)量不斷減少，優(yōu)良種羊流失，品種資源保護(hù)形勢嚴(yán)峻[3]。這一問題引起相關(guān)政府部門足夠的重視，對濟(jì)寧青山羊的育種與改良開展了大量工作，使得濟(jì)寧青山羊養(yǎng)殖業(yè)步入良性發(fā)展軌道。經(jīng)過系統(tǒng)的選種選配、提純復(fù)壯、核心群選育和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，濟(jì)寧青山羊種群數(shù)量、羊群整體質(zhì)量得到顯著提高。為了進(jìn)一步摸清濟(jì)寧青山羊品種資源最新動(dòng)態(tài)及其遺傳結(jié)構(gòu)和起源分化，本研究應(yīng)用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)，對濟(jì)寧青山羊群體遺傳多樣性和群體間的遺傳分化進(jìn)行分析。

濟(jì)寧青山羊是在當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境條件下，經(jīng)過數(shù)百年的選育形成的優(yōu)良地方品種，一直保持著閉鎖的繁殖方式，沒有受外來品種的影響，是非常寶貴的資源。目前，對濟(jì)寧青山羊分子遺傳方面的研究甚少，且多集中于對其繁殖性能相關(guān)候選基因的多態(tài)性研究[4-6]等方面，而在其種群和遺傳多樣性方面的研究相對滯后。所以，對濟(jì)寧青山羊的種群進(jìn)行深入研究，掌握其資源現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢，對制定合理有效的保種策略，促進(jìn)濟(jì)寧青山羊品種資源的保護(hù)、開發(fā)及利用具有深遠(yuǎn)的意義。

1材料與方法

1.1樣本采集

試驗(yàn)樣本分別采自山東省4個(gè)濟(jì)寧青山羊種群血樣或小塊耳組織，共計(jì)135份（表1），個(gè)體之間無親緣關(guān)系，品種的外貌特征明顯。

1.2DNA提取

采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒或常規(guī)酚氯仿抽提法提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑與儀器

試劑：血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司;PCRMix、DNAMarker等，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

儀器：Eppendorf高速臺(tái)式離心機(jī)、EppendorfPCR擴(kuò)增儀、電熱恒溫水槽、BIO-RAD凝膠成像儀及電泳系統(tǒng)、ABI3100-Avant全自動(dòng)基因序列分析儀。

1.4微衛(wèi)星引物

參照聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）及國際遺傳學(xué)會(huì)（ISAG）的推薦，共篩選出24對熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：PCRMix6.25μL，上下游引物（10mmol/L）各1μL，模板DNA1μL，補(bǔ)水至12.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5min;94℃30s，54、55、58℃或65℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán);72℃5min。

1.6微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

PCR產(chǎn)物、去離子甲酰胺、TAMRA（FAM或HEX）以0.5μL∶10μL∶0.5μL的比例混合，95℃變性5min，采用ABI3100-Avant全自動(dòng)基因序列分析儀進(jìn)行分析，用3100DataCollection軟件分析微衛(wèi)星基因型。

1.7數(shù)據(jù)分析

用POPGEN1.32計(jì)算有效等位基因數(shù)（Ne）、雜合度及基因流等。多態(tài)信息含量（PIC）用PIC分析軟件計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

利用ABI3100-Avant全自動(dòng)基因序列分析儀對135個(gè)樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型測定，部分結(jié)果見圖1和圖2。24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的電泳圖峰形典型，易于判型，適于后續(xù)分析。

2.2群體內(nèi)遺傳變異分析

微衛(wèi)星位點(diǎn)上的觀察等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）能夠反映群體內(nèi)的變異程度，4個(gè)群體24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物共檢測到159個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)為6.6個(gè)，各位點(diǎn)有效等位基因數(shù)范圍為1.3423～6.4800，平均有效等位基因數(shù)3.5282（表3），說明選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記在4個(gè)群體中具有多態(tài)性，適宜群體間遺傳關(guān)系的分析。

由表4可知，濟(jì)寧青山羊具有豐富的遺傳多樣性。4個(gè)群體的PIC在0.6016～0.6653之間，各群體He也較高（0.6750～0.7559），但是群體的Ho均低于He，LWQ最低為0.5375，JXQ最高為0.6260。

2.3群體間遺傳關(guān)系分析

從整個(gè)濟(jì)寧青山羊種群來看，群體內(nèi)近交系數(shù)（Fis）為0.1099，其中有5個(gè)位點(diǎn)的Fis為負(fù)值，總?cè)后w近交系數(shù)（Fit）為0.2138，其中CSRD247基因座的Fit為負(fù)值，說明群體存在一定程度的近交，但群體內(nèi)雜合體較多，近交程度尚不嚴(yán)重。群體間基因分化系數(shù)（Fst）為0.0774，說明7.741%的遺傳變異是由群體間差異引起的，而92.259%的遺傳變異是由各群體內(nèi)個(gè)體間的差異引起的，群體間的遺傳分化水平較低?；蛄鳎∟m）分析表明，每世代4個(gè)群體間有效遷移個(gè)體數(shù)為1.8905，說明群體間存在一定的基因交流（表5）。

2.4遺傳距離和遺傳相似性指數(shù)分析

由表6可知，SXQ、HHQ和JXQ群體間遺傳距離較近，遺傳相似性指數(shù)較高，表明3個(gè)群體間具有較近的親緣關(guān)系。而LWQ與3個(gè)群體間遺傳距離相對較遠(yuǎn)，遺傳相似性指數(shù)相對較低，因此，群體間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2.54個(gè)群體之間的聚類分析

由圖3可知，SXQ與HHQ群體的遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，首先聚在一起;然后兩者再與JXQ群體聚合，三者與LWQ群體的遺傳距離相對較遠(yuǎn)。SXQ、HHQ和JXQ位于山東省的濟(jì)寧、菏澤地區(qū)，為濟(jì)寧青山羊主產(chǎn)區(qū)，而LWQ位于邊緣產(chǎn)區(qū)萊蕪，可見地理距離與遺傳距離具有較強(qiáng)的正相關(guān)性。

3討論與結(jié)論

Barker等[7]提出要滿足微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記研究的需要，每個(gè)群體的樣本數(shù)量不能小于25。湯青萍等[8]認(rèn)為，利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性檢測時(shí)，選擇的引物應(yīng)盡量均勻地分布于物種的各染色體上，引物數(shù)量應(yīng)不低于20對，這樣結(jié)果才較準(zhǔn)確。本研究采用的24個(gè)位點(diǎn)分布于9條染色體上，分析的個(gè)體數(shù)量、選用的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量都基本達(dá)到了遺傳多樣性檢測的要求，具有一定的可靠性。

本試驗(yàn)檢測到的JXQ和HHQ的有效等位基因數(shù)略高于SXQ和LWQ的，其中以LWQ的有效等位基因數(shù)最低，表明各群體之間的遺傳結(jié)構(gòu)存在差異，分析原因一方面可能是由于地理位置差異造成的，另一方面也可能與人工選擇有關(guān)。采樣的群體規(guī)模小、數(shù)量少，選育過程中存在的人為因素都可對群體的基因平衡產(chǎn)生影響[9]。4個(gè)群體的等位基因數(shù)均高于有效等位基因數(shù)，根據(jù)Hines等[10]的研究，這可能與近交有關(guān)，導(dǎo)致等位基因分布不均勻。

Botstein等[11]提出多態(tài)信息含量（PIC）是用來描述微衛(wèi)星標(biāo)記的變異程度和估計(jì)群體內(nèi)的遺傳變異程度，當(dāng)PIC>0.5時(shí)為高度多態(tài)標(biāo)記，0.25

遺傳分化系數(shù)（Fst）可以反映群體近交或群體間遺傳分化程度[12]。本研究中Fst為0.0774，說明4個(gè)群體間的遺傳分化水平低，而且基因流大于1（1.8905），均質(zhì)化作用強(qiáng)，能夠抵制遺傳漂變作用，防止群體間遺傳分化發(fā)生。結(jié)果表明濟(jì)寧青山羊已經(jīng)在遺傳水平上形成了相對獨(dú)立的體系，依據(jù)不同地理位置形成了不同的生態(tài)類型。

總之，通過近年來加大對濟(jì)寧青山羊的保護(hù)力度，群體的遺傳多樣性得到了保留，群體間的基因流較大，遺傳分化水平較低。從保種效果來看，JXQ屬于國家級保種場，每年都得到政府的經(jīng)費(fèi)支持，遺傳基礎(chǔ)比較好，保留了濟(jì)寧青山羊最完整、最原始的優(yōu)良基因，多態(tài)信息含量最高。LWQ位于邊緣產(chǎn)區(qū)，可能由于長期的地理隔離和生理隔離，群體數(shù)量不大，群體的同質(zhì)性加大，遺傳多樣性丟失，平均雜合度降低。另外，從整個(gè)濟(jì)寧青山羊群體來看，都存在不同程度的近交，JXQ和HHQ的近交程度稍低于SXQ和LWQ，所以在實(shí)際保種工作中，應(yīng)擴(kuò)大群體數(shù)量，盡量避免近交，以維持濟(jì)寧青山羊群體的遺傳多樣性。

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