李改芬， 趙 名， 趙 彤， 成 祥， 范 明△， 朱玲玲△

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)腦重大疾病研究中心， 北京腦重大疾病研究院， 北京 100069； 2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所， 北京 100850)

抑郁癥是一種比較常見(jiàn)的情感障礙性疾病，近年來(lái)其發(fā)病率越來(lái)越高，嚴(yán)重影響患者的身心健康，觀察發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致抑郁癥患者發(fā)病的原因大多是由于各種各樣的壓力刺激所致，包括外在環(huán)境壓力和內(nèi)在精神壓力[1]。雖然在當(dāng)前抑郁癥的確切發(fā)病機(jī)制還未查明，但經(jīng)前期大量研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥被認(rèn)為是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與海馬的病理變化呈正相關(guān)[2]。眾所周知，糖尿病是一種常見(jiàn)的慢性疾病，在疾病的長(zhǎng)期折磨下，糖尿病患者并發(fā)抑郁癥的人數(shù)明顯高于正常人[3]。臨床調(diào)研發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并抑郁癥的患者經(jīng)過(guò)抗糖尿病治療后，不僅血糖得到有效控制，抑郁癥狀也有所減輕[4]。二甲雙胍是目前治療2型糖尿病的臨床一線藥物，其藥理作用不僅包括降低血糖，還有抗衰老和神經(jīng)保護(hù)的作用[5]；并且二甲雙胍聯(lián)合抗壞血酸能夠減輕糖尿病和抑郁癥共患病患者的抑郁癥狀[6]，因此，本研究在慢性不可預(yù)測(cè)性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS) 大鼠抑郁模型上探討二甲雙胍的抗抑郁作用及其初步的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

SPF級(jí)的SD大鼠40只，8周齡，體重(280～300)g，雄性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，質(zhì)量合格證號(hào)：11400700259457。 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，室溫(23±2)℃，濕度50%～70 %，光照與黑暗交替為12 h /12 h，可自由飲水?dāng)z食。

二甲雙胍(S1741)，由碧云天生物技術(shù)有限公司提供。二甲雙胍用生理鹽水溶解，新鮮配制，每天腹腔注射100 mg/kg，處理時(shí)間為14 d[7-9]。

1.2 CUMS抑郁模型的建立

按照文獻(xiàn)方法[2，10]進(jìn)行抑郁大鼠模型的復(fù)制。刺激包括鼠籠傾斜45° 24 h，束縛應(yīng)激2 h，潮濕墊料24 h，禁食24 h，禁水24 h，夾尾1 min，4℃冰水游泳5 min，45℃熱刺激5 min，噪音2 h，持續(xù)照明24 h，閃光燈照明24 h(光暗周期2 h / 2 h)。上述11種應(yīng)激隨機(jī)安排，每天1種刺激，相鄰兩天同一刺激不可連續(xù)出現(xiàn)，使大鼠不能預(yù)測(cè)應(yīng)激。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

將動(dòng)物隨機(jī)分為4組(n=10)：對(duì)照組(CON組)、二甲雙胍組(MET組)、模型組(CUMS組)、模型+二甲雙胍組(CUMS+MET組)；兩個(gè)二甲雙胍組在模型制備完成后每天腹腔注射二甲雙胍(100 mg/kg)1 ml，對(duì)照組和模型組注射等體積的生理鹽水，連續(xù)注射14 d。所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及實(shí)驗(yàn)均遵守中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例和軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

(1)體重測(cè)量：在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，測(cè)一次大鼠體重，各組大鼠體重?zé)o差異。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每周測(cè)一次體重。(2)糖水偏好實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練期：每只大鼠禁水禁食23 h，然后給予一瓶1%糖水和一瓶純水，每隔5 min交換一下水瓶的位置，持續(xù)1 h。測(cè)試期：每只大鼠禁水禁食23 h后給予提前稱好的1%糖水和純水，每隔5 min交換一下水瓶位置，持續(xù)1 h，最后記錄兩個(gè)水瓶消耗量并計(jì)算糖水偏愛(ài)率，糖水偏愛(ài)率=1%糖水飲用量/(1%糖水飲用量+純水飲用量)。(3)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入盛有40 cm水的水池中，確保大鼠尾尖觸碰不到水池底部，強(qiáng)迫大鼠游泳，水溫為室溫，每只大鼠單獨(dú)測(cè)試，每次測(cè)試5 min，觀察并記錄大鼠累計(jì)游泳不動(dòng)時(shí)間。靜止不動(dòng)：停止掙扎或呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面。(4)懸尾不動(dòng)實(shí)驗(yàn)：將大鼠尾端3 cm部位固定在水平木棍上，使大鼠呈倒懸狀態(tài)，頭部距地面5 cm左右，每只大鼠單獨(dú)測(cè)試，測(cè)試5 min，觀察每只大鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間并計(jì)時(shí)。(5)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用ANY-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)檢測(cè)大鼠的自主活動(dòng)情況，每只大鼠提前適應(yīng)5 min，然后將大鼠放入九宮格中，每次放1只，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄大鼠的活動(dòng)情況，每次5 min。每只動(dòng)物測(cè)試完畢將場(chǎng)地清理干凈，并用酒精噴灑祛除異味。主要觀察指標(biāo)為總運(yùn)行距離和在中央?yún)^(qū)域運(yùn)行的距離。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

所有行為學(xué)測(cè)試完畢后進(jìn)行動(dòng)物取材，將動(dòng)物用戊巴比妥(60 mg/kg, 腹腔注射)進(jìn)行麻醉，斷頭并剝離腦組織將其放入預(yù)先準(zhǔn)備好的組織固定液(4%多聚甲醛)中固定并保存。

1.6 尼氏染色

(1)將切好的石蠟切片放入烤箱，65℃過(guò)夜；(2)第2日將切片取出放入二甲苯中脫蠟，每次10 min，共3次；(3)將切片依次放入100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中脫水，各2 min，然后用蒸餾水沖洗3次，每次5 min；(4)將切片放入提前備好的1%甲苯胺藍(lán)中進(jìn)行染色，37℃孵育30 min，然后用蒸餾水沖洗3次，每次5 min；(5)95%乙醇分化至尼氏小體呈藍(lán)色；(6)100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)CUMS大鼠體重的影響

抑郁癥的臨床表現(xiàn)中包括食欲不振，因此我們每周測(cè)一次大鼠的體重，觀察各組大鼠的體重增長(zhǎng)變化。體重測(cè)量結(jié)果如表1顯示：CON組與MET組相比，兩組大鼠體重增長(zhǎng)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CUMS組與CUMS+MET組相比，兩組大鼠體重增長(zhǎng)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示二甲雙胍腹腔注射不會(huì)影響大鼠的體重增長(zhǎng)。但是與CON組相比，CUMS組大鼠體重增長(zhǎng)明顯較慢(P<0.01或P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)過(guò)二甲雙胍處理后， CUMS大鼠的體重增長(zhǎng)仍然明顯較慢，再次提示二甲雙胍腹腔注射不會(huì)影響大鼠的體重增長(zhǎng)，并且說(shuō)明CUMS可以導(dǎo)致大鼠體重增長(zhǎng)減慢。

Tab. 1 Effects of metformin on the rats’ body weight (g, n=10)

CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group

2.2 二甲雙胍對(duì)CUMS大鼠糖水偏愛(ài)的影響

糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)大鼠是否有快感缺乏，而快感缺乏是抑郁癥的癥狀之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示：3周CUMS應(yīng)激后，CUMS組和CUMS+MET組大鼠的糖水偏愛(ài)率與CON組相比均明顯降低(P<0.01或P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CUMS抑郁模型可以建立成功；5周CUMS應(yīng)激后即二甲雙胍注射2周后，與CON組相比， CUMS組大鼠的糖水偏愛(ài)率明顯降低，而CUMS+MET組大鼠的糖水偏愛(ài)率有所上升(P<0.01或P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示二甲雙胍可以改善CUMS大鼠的糖水偏愛(ài)率。

GroupAfter 3 weeks of CUMSAfter 5 weeks of CUMSCON60.94±5.9463.36± 5.24MET60.68±5.0661.19± 6.22CUMS37.45±3.22**48.72±15.44*CUMS+MET37.62±3.40**59.31±17.14#

In this experiment, CUMS stress stimulation lasted for 5 weeks, metformin was injected intraperitoneally in the last 2 weeks. CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group;#P<0.05vsCUMS group

2.3 二甲雙胍對(duì)CUMS大鼠的懸尾不動(dòng)和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)的影響

懸尾不動(dòng)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)大鼠是否具有絕望無(wú)助行為表現(xiàn)，絕望無(wú)助是抑郁癥的重要表型之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示：與CON組相比， CUMS組大鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間均明顯延長(zhǎng)(P<0.01或P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CUMS組大鼠出現(xiàn)絕望無(wú)助行為。與CUMS組比較，二甲雙胍注射兩周后，CUMS+NET組大鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.01或P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是大鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間沒(méi)有明顯減少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示二甲雙胍可以改善大鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)。

GroupTSTFSTCON104.66±48.2104.50±2.953MET88.70±26.7084.80±2.043CUMS138.61±35.593*44.56±16.627**CUMS+MET104.85±37.63226.80±15.339#

TST: Tail suspension test; FST: Forced swimming test; CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group；#P<0.05vsCUMS group

2.4二甲雙胍對(duì)CUMS大鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

自發(fā)活動(dòng)可以說(shuō)明大鼠的抑郁狀態(tài)，自發(fā)活動(dòng)減少說(shuō)明大鼠處于抑郁狀態(tài)中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1顯示：與CON組相比， CUMS組大鼠在曠場(chǎng)中總運(yùn)行距離減少、在中央?yún)^(qū)域運(yùn)行距離減少、穿越中央?yún)^(qū)域的次數(shù)減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CUMS組大鼠處于抑郁狀態(tài)中，而經(jīng)過(guò)二甲雙胍處理后的CUMS+MET組的大鼠在曠場(chǎng)中總運(yùn)行距離增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在中央?yún)^(qū)域運(yùn)行距離沒(méi)有顯著增多、穿越中央?yún)^(qū)域次數(shù)沒(méi)有顯著增多，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是具有增多的趨勢(shì)；綜上結(jié)果，提示二甲雙胍可以增加CUMS大鼠的自發(fā)活動(dòng),改善其抑郁狀態(tài)。

CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group；#P<0.05vsCUMS group

2.5 二甲雙胍對(duì)CUMS大鼠海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

既往報(bào)道提示，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致海馬的功能和形態(tài)發(fā)生異常改變，尤其是海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)對(duì)慢性應(yīng)激刺激比較敏感。正常情況下，大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、染色均一、細(xì)胞排列整齊。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)可得：CON組和MET組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)的細(xì)胞排列較為整齊，染色均一，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。而CUMS組與CON組相比，其大鼠海馬CA1和CA3區(qū)細(xì)胞排列紊亂、個(gè)數(shù)減少、染色變淺、細(xì)胞之間的間隙增大；經(jīng)過(guò)二甲雙胍處理后的CUMS+MET組大鼠的海馬CA1和CA3區(qū)的細(xì)胞排列紊亂、個(gè)數(shù)減少、染色較淺、細(xì)胞間隙增大的問(wèn)題有所改善。上述海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)變化提示二甲雙胍可以修復(fù)CUMS導(dǎo)致的海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂。

3 討論

CUMS是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的動(dòng)物抑郁癥模型，因其能模擬抑郁癥的環(huán)境誘因，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)抑郁核心癥狀,所有被廣泛應(yīng)用于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和抗抑郁新藥研究[11]。大腦海馬是應(yīng)激反應(yīng)的作用靶區(qū)，參與情緒反應(yīng)和學(xué)習(xí)記憶，其損傷與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]；而且糖尿病與抑郁癥皆可損傷海馬血腦屏障的完整性[12]。因此本實(shí)驗(yàn)采用二甲雙胍對(duì)CUMS抑郁模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其療效及其可能的作用機(jī)制，并作尼氏染色觀察各組大鼠海馬形態(tài)變化。行為學(xué)結(jié)果顯示CUMS抑郁模型大鼠體重增長(zhǎng)顯著減慢，糖水消耗量顯著降低，懸尾不動(dòng)和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，自發(fā)活動(dòng)明顯減少，表明CUMS大鼠出現(xiàn)快感缺乏、絕望無(wú)助癥狀，處于抑郁狀態(tài)，抑郁模型建立成功。經(jīng)過(guò)二甲雙胍處理，CUMS大鼠海馬的CA1和CA3區(qū)的神經(jīng)元得到明顯恢復(fù)，抑郁行為得到明顯改善；與既往報(bào)道一致，上述行為學(xué)的改變與大鼠海馬的形態(tài)變化保持一致，表明二甲雙胍發(fā)揮抗抑郁的效應(yīng)可能與修復(fù)受損的海馬有關(guān)。

Fig.2Effects of metformin on hippocampal morphology in CUMS rats(Nissl staining,n=3)

CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and Metformin group; Hipp: Hippocampus. The districts of CA1 and CA3 are the part of the gray box shown in the top picture respectively, both of their magnification times are 40x

近年來(lái)糖尿病和抑郁癥兩病共患的發(fā)病率逐漸升高，在糖尿病并發(fā)抑郁癥的患者中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)抗糖尿病藥物的治療，患者的血糖和抑郁癥狀都得到了有效的控制，因此，越來(lái)越多的抗糖尿病藥物被用于研究其是否具有抗抑郁的效應(yīng)以及可能的作用機(jī)制。研究報(bào)道慢性應(yīng)激刺激可導(dǎo)致大鼠的血糖含量水平升高，血糖升高導(dǎo)致炎癥因子釋放增多、氧化應(yīng)激加強(qiáng)，從而加重抑郁癥的癥狀；二甲雙胍是一種常見(jiàn)的Ⅱ型抗糖尿病藥，經(jīng)過(guò)降低血糖、增加胰島素含量，聯(lián)合抗壞血酸減少氧化應(yīng)激而發(fā)揮抗抑郁作用[6]。根據(jù)已有研究：50、75、100、150 mg/kg的二甲雙胍連續(xù)腹腔注射21 d[7]，100 mg/kg的二甲雙胍連續(xù)口服4周都能夠改善CUMS誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為[8]，加上我們實(shí)驗(yàn)室前期研究[9]，本實(shí)驗(yàn)選擇采用100 mg/kg的劑量連續(xù)腹腔注射14d觀察二甲雙胍對(duì)CUMS誘導(dǎo)的抑郁行為的影響，結(jié)果顯示，二甲雙胍可以明顯改善大鼠的快感缺乏、絕望無(wú)助和焦慮不安等抑郁行為。

抑郁癥在當(dāng)前被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)疾病，隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍除了具有治療糖尿病的效應(yīng)外，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病也有一定的保護(hù)效應(yīng)，例如：在阿爾茨海默病中，二甲雙胍通過(guò)阻止PP2A與MID的結(jié)合，增加PP2A的生物活性，抑制MAPT磷酸化，減少NFTs形成；通過(guò)上調(diào)胰高血糖素生物活性，減低胰島素抵抗，抑制神經(jīng)元損害，激活神經(jīng)干細(xì)胞，改善大腦神經(jīng)損傷，改善阿爾茨海默病的認(rèn)知障礙[13]。在MPTP誘導(dǎo)的帕金森小鼠模型中，二甲雙胍可以抑制MPTP誘導(dǎo)的α突觸核蛋白的磷酸化，上調(diào)蛋白磷酸酶2A的甲基化，抑制黑質(zhì)紋狀體路徑中的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，增加黑質(zhì)中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平；二甲雙胍還能激活A(yù)MPK，調(diào)節(jié)代謝能量分布，增加紋狀體多巴胺含量，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，減輕MPP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，減少神經(jīng)元死亡，對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森小鼠發(fā)揮治療作用[14]。二甲雙胍被FDA認(rèn)可是能夠促進(jìn)神經(jīng)再生優(yōu)化的藥物，不僅可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，還能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化，因此能夠減少缺血性腦卒中的梗死區(qū)域并促進(jìn)其恢復(fù)[15]。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對(duì)高原低氧誘導(dǎo)的認(rèn)知損傷具有保護(hù)效應(yīng)[9]，其作用機(jī)制可能與修復(fù)高原低氧誘導(dǎo)的海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂有關(guān)。

綜上所述，二甲雙胍能夠改善CUMS誘導(dǎo)的抑郁行為，其機(jī)制可能與修復(fù)受損的海馬結(jié)構(gòu)有關(guān)，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。