夏天光， 朱 旭,2， 王景景， 魏孟廣， 呂方方， 陳 翀， 梁 軍， 姜 偉， 孫 倩， 孫洪濤△

(1. 武警特色醫(yī)學(xué)中心腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所， 天津 300162； 2. 邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外科， 河北 056002； 3. 天津大學(xué)醫(yī)學(xué)工程與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院， 天津 300072)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是導(dǎo)致青少年殘疾和死亡的主要原因之一[1,2]。TBI可導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)和記憶障礙，這是由于TBI引起的海馬神經(jīng)元死亡所致[3]。促進(jìn)神經(jīng)元再生被認(rèn)為是較好的治療TBI的策略之一，新生神經(jīng)元在學(xué)習(xí)和記憶中起著重要的作用[4]。然而，創(chuàng)傷后不能成熟的新生神經(jīng)元將在新生后第一周至第二周死亡。損傷區(qū)缺氧和毒素累積導(dǎo)致新生細(xì)胞成熟度下降[5,6]。因此，改善TBI后新生神經(jīng)元的存活率和誘導(dǎo)神經(jīng)元成熟是TBI后面臨的主要挑戰(zhàn)之一。

在神經(jīng)元發(fā)育過程中，動作電位對新生神經(jīng)元的成熟和功能性突觸的形成至關(guān)重要[7]。研究人員利用電極刺激使細(xì)胞膜去極化產(chǎn)生動作電位激活神經(jīng)元回路[8]。光遺傳學(xué)方法中藍(lán)光可激活視紫紅質(zhì)通道蛋白-2(channelrhodopsin-2，ChR2)，使膜去極化并觸發(fā)動作電位。特定啟動子下的ChR2工程細(xì)胞為膜去極化和神經(jīng)元興奮的研究提供一種新的且強(qiáng)有力的方法。利用光遺傳學(xué)方法產(chǎn)生動作電位克服了傳統(tǒng)技術(shù)的局限性，可以從時間和空間上精確操控新生神經(jīng)元的電生理活動。

Wnt信號通路主要調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等過程，其中，經(jīng)典的Wnt/β-actenin 信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起重要的作用[9]。本研究中，我們用攜帶DCX-ChR2-EGFP基因的慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSCs)，DCX識別新生神經(jīng)元并觀察光遺傳學(xué)能否通過ChR2通道蛋白誘導(dǎo)膜電位產(chǎn)生動作電位促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟。同時，我們進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟過程中Wnt/β-catenin信號途徑相關(guān)分子水平的變化，以探索Wnt/β-catenin和新生神經(jīng)元成熟的關(guān)系，為后續(xù)研究光遺傳學(xué)誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟治療TBI奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)動物為孕14 d的SD大鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)儀器：離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司)，SA300V型全自動高壓滅菌儀(美國Thermo Fisher公司)，自動超純水儀(美國Thermo Fisher公司)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)，相差倒置熒光顯微鏡及照相裝置(德國Leica公司)。實(shí)驗(yàn)試劑：熒光標(biāo)記二抗(Sigma公司)，神經(jīng)巢蛋白(Nestin)抗體(Pharmingen公司)，胎牛血清和含有F12的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。DCX-ChR2-EGFP和DCX-EGFP基因的慢病毒(中國上海和元生物公司)。

1.2 NSCs的分離與培養(yǎng)

NSCs分離與培養(yǎng)步驟[10]如下：將SD大鼠乙醚麻醉后置于75%乙醇中浸泡1 min，冰上取胎鼠大腦皮層組織，眼科剪剪碎，置于培養(yǎng)基中用200目不銹鋼濾網(wǎng)進(jìn)行研磨，過濾后得到細(xì)胞懸液。將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中1 000 r/min離心5 min，棄上清液。經(jīng)0.25%胰酶消化后再次離心5 min，棄上清后加入NSCs培養(yǎng)基(DMEM/F12，20 ng/ml EGF，20 ng/ml bFGF和2% B27添加劑)重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1.5×106cells/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中。2～3 d靜置換液，每7 d傳代1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組(n=3)：對照組、NSCs+EGFP和NSCs+ChR2組。其中對照組為正常培養(yǎng)的NSCs(NSCs組)；NSCs+EGFP組為攜帶DCX-EGFP基因慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞組；NSCs+ChR2組為攜帶DCX-ChR2-EGFP基因慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞組。

1.4 慢病毒感染攜帶DCX-ChR2-EGFP和DCX-EGFP基因的新生神經(jīng)元并采用光學(xué)刺激新生神經(jīng)元

分別用攜帶DCX-ChR2-EGFP和DCX-EGFP基因的慢病毒感染新生神經(jīng)元。病毒顆粒滴度約為每毫升3×108粒。感染復(fù)數(shù)(MOI)為1∶50。然后采用470 nm DPSS激光器(OEM 激光系統(tǒng))激發(fā)產(chǎn)生藍(lán)色激光，通過標(biāo)準(zhǔn)的40倍浸水顯微鏡物鏡照射在培養(yǎng)基中(脈沖5 ms，2Hz)。病毒感染48 h后，連續(xù)3 d藍(lán)激光照射各組NSCs。

1.5 采用L-型鈣通道阻斷劑維拉帕米或β-catenin抑制劑Dkk1干預(yù)NSCs+ChR2組細(xì)胞

慢病毒DCX-ChR2-EGFP感染NSCs 48 h后，采用L-型鈣通道阻斷劑100 μmol/L維拉帕米或50 μg/ml的β-catenin抑制劑Dkk1處理NSCs+ChR2組細(xì)胞，然后行Western blot檢測各組MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表達(dá)水平。

1.6 Western blot檢測各組MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2、TCF4和β-catenin蛋白表達(dá)水平

提取對照組、NSCs+EGFP組和NSCs+ChR2組細(xì)胞蛋白，根據(jù)BCA試劑盒測定上清液中蛋白質(zhì)的濃度，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，NC膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2、TCF4和β-catenin)，4℃孵育過夜，次日，小鼠或抗兔IgG二抗(1∶5 000)在37℃下孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色法顯色并曝光顯影。用定量軟件(Bio-Rad)測定灰度值。

在NSCs+ChR2組培養(yǎng)基中加入100 μm維拉帕米或50 μg/ml Dkk 1進(jìn)行功能阻斷實(shí)驗(yàn)。再按照上述步驟測定MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白的表達(dá)。

1.7 免疫熒光染色檢測各組DCX和NeuN的表達(dá)情況

光刺激3 d后，各組細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定30 min，加入0.5% Triton X-100破膜30 min， BSA封閉15 min，加入一抗DCX和NeuN 4℃孵育過夜，次日，加入相應(yīng)的熒光二抗孵育1 h，然后行Hoechst染色后緩沖甘油封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3組NeuN+陽性細(xì)胞和NeuN+/Hoechst比值的比較

各組細(xì)胞經(jīng)470 nm 藍(lán)光連續(xù)照射3 d后，NSCs組、NSCs+EGFP和NSCs+ChR2三組均有成熟神經(jīng)元表達(dá)的NeuN+(紅色)，NeuN+細(xì)胞密度分別為7350±632、8400±713、18700±1185。NSCs+ChR2組NeuN+陽性細(xì)胞密度顯著高于NSCs組和NSCs+EGFP組(圖1A，P<0.01)，而NSCs組和NSCs+EGFP組二者之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組NeuN+/Hoechst比值分別為82±7、80±4和93±8。NSCs+ChR2組NeuN+/Hoechst比值顯著高于NSCs組和NSCs+EGFP組(P<0.05，圖1見彩圖頁Ⅰ)。

2.2 ChR2通道對MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)水平的影響

與NSCs組和NSCs+EGFP組相比，MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá)(P<0.01)。NSCs組與NSCs+EGFP組兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，表1)。

Fig.2The effects of ChR2 channel on the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1and GluR2 protein

2.3 維拉帕米拮抗鈣離子通道對MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)水平的影響

與NSCs組對比， MAP2、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。加入維拉帕米抑制劑(Verap組)后，與NSCs+ChR2組相比，MAP2、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)明顯被抑制(P<0.05)。NeuN蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá)，與NSCs組對比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入維拉帕米抑制劑(Verap組)后，NeuN蛋白表達(dá)明顯被抑制，與NSCs+ChR2組對比(圖3，表2)。

Tab. 1 Quantitative analysis of the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 n=3)

NSCs: Neural stem cells

**P<0.01vsNSCs group

Fig.3The effects of calcium channel blocker verapamil on the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 protein

2.4 Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin和TCF4的表達(dá)結(jié)果

β-catenin和TCF4蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá)，與NSCs組和NSCs+ EGFP組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4，表1)。

2.5 β-catenin抑制劑Dkk1對MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)的影響

MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá)，與NSCs組對比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。加入β-catenin抑制劑Dkk1(Dkk1組)后，與NSCs+ChR2組對比，MAP2、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)明顯被抑制(P<0.05，P<0.01)。NeuN蛋白表達(dá)明顯被抑制，與NSCs+ChR2組對比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，圖5，表3)。

3 討論

TBI后新生神經(jīng)元的成熟度較低，本研究選擇光遺傳學(xué)方法激活新生神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位，以提高神經(jīng)元的成熟度。為了得到具有DCX-ChR2-EGFP陽離子通道的新生神經(jīng)元，本研究利用攜帶DCX-ChR2-EGFP基因的慢病毒感染從胎鼠提取并在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞。470 nm的藍(lán)光可以有效刺激ChR2通道開放，陽離子內(nèi)流產(chǎn)生細(xì)胞膜動作電位。這些電生理的變化可以通過Wnt/-catenin信號通路促進(jìn)新生神經(jīng)元的成熟。

電活動存在于成體神經(jīng)發(fā)生的各個階段，通過基因表達(dá)和信號調(diào)節(jié)影響新生細(xì)胞的成熟，尤其在神經(jīng)分化階段起著關(guān)鍵作用[11,12]。研究表明，有絲分裂后神經(jīng)細(xì)胞通過膜去極化引起鈣離子通道開放，鈣離子內(nèi)流來影響神經(jīng)元的存活、成熟并產(chǎn)生功能活動[13]。細(xì)胞膜上的鈣通道開放可以抑制新生神經(jīng)元分化為膠質(zhì)細(xì)胞并激活NeuroD基因使新生神經(jīng)元向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化[7]。細(xì)胞去極化的方法很多，然而傳統(tǒng)的電生理技術(shù)缺乏精確控制對靶向細(xì)胞的刺激，無法達(dá)到調(diào)控神經(jīng)元或特定種類細(xì)胞電生理活動的目的[14]。光遺傳學(xué)是利用基因工程將光敏感性離子通道蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞或動物體內(nèi)，以特定波長的外源性光照射(刺激)激活或抑制表達(dá)在細(xì)胞或動物體內(nèi)的光敏感通道蛋白形成離子流，引起細(xì)胞膜電位超級化或去極化，從而達(dá)到調(diào)控從時間和空間上精確調(diào)控細(xì)胞的電生理活動的目的[15]。如今，光遺傳學(xué)通過激活靶向基因刺激神經(jīng)元電生理活動的技術(shù)已被用于多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭醒芯繌?fù)雜神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的功能[16,17]。然而，大多數(shù)研究使用光遺傳學(xué)調(diào)控細(xì)胞群或神經(jīng)回路。光遺傳學(xué)調(diào)控光敏陽離子通道ChR2產(chǎn)生動作電位促進(jìn)神經(jīng)元成熟很少被研究。本研究中，光遺傳學(xué)作為細(xì)胞膜去極化產(chǎn)生動作電位的工具，CHR2通道是細(xì)胞產(chǎn)生電活動變化的途徑，利用DCX-ChR2-EGFP慢病毒感染細(xì)胞并表達(dá)，驗(yàn)證光遺傳學(xué)促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCs組、NSCs+EGFP和NSCs+ChR2三組均有成熟神經(jīng)元表達(dá)，NSCs+ChR2組成熟神經(jīng)元陽性細(xì)胞密度顯著高于NSCs組和NSCs+EGFP組。提示光遺傳學(xué)能通過ChR2通道蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位并促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟。同時，還進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟過程中Wnt/β-catenin信號途徑相關(guān)分子水平的變化，以探索Wnt/β-catenin和新生神經(jīng)元成熟的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用L-型鈣通道阻斷劑維拉帕米或β-catenin抑制劑Dkk1后，神經(jīng)元的成熟過程受到抑制，說明光誘導(dǎo)ChR2通道產(chǎn)生動作電位與鈣離子內(nèi)流具有較高的相關(guān)性。

Tab. 2 Quantitative analysis of the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsthe NSCs group;#P<0.05,##P<0.01vsChR2 group

Fig.4The expressions of β-catenin and TCF4 associated with Wnt/β-catenin signal channel

Fig.5The effects of β-catenin inhibitor Dkk1 on the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 protein

Tab. 3 Quantitative analysis of the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 protein n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsthe NSCs group;#P<0.05,##P<0.01vsChR2 group

DCX(Doublecortin)基因編碼一種40 kDa的雙鏈微管相關(guān)蛋白，缺乏DCX的新生神經(jīng)元會產(chǎn)生嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)缺陷和遲發(fā)性遷移。DCX主要在神經(jīng)元前體和新生神經(jīng)元中表達(dá)[18,19]。研究證實(shí)，新生細(xì)胞成熟經(jīng)歷了兩個關(guān)鍵時期，一個是中間祖細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞時期，另一個是未成熟神經(jīng)元整合時期[20]。新生神經(jīng)元在這兩個關(guān)鍵時期均表達(dá)DCX。Walker等[21]從孕鼠，新生鼠和成年鼠腦中分離DCX陽性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DCX陽性細(xì)胞在神經(jīng)元前體階段的表達(dá)是較高的。另外，在成年人的神經(jīng)發(fā)生過程中，DCX只在增殖的神經(jīng)元祖細(xì)胞和有絲分裂后的神經(jīng)元前體中短暫表達(dá)[22]。慢病毒轉(zhuǎn)入DCX基因使新生神經(jīng)元具有較長的觀察時間窗。在本實(shí)驗(yàn)中，用攜帶DCX-ChR2-EGFP基因的慢病毒感染新生神經(jīng)元，利用DCX的表達(dá)水平檢測光遺傳學(xué)對細(xì)胞成熟度的影響，發(fā)現(xiàn)激光照射3 d后新生神經(jīng)元的DCX表達(dá)量明顯下降，證明光遺傳學(xué)方法促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟是可行的。

Wnt信號通路在新生神經(jīng)元的神經(jīng)分化中起著重要的作用，近年來成為各種疾病機(jī)制研究的熱點(diǎn)[23]。Wnt信號通路中，β-catenin是TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活因子，同時調(diào)節(jié)Wnt靶基因的表達(dá)，其中包括NeuroD1[24]。NeuroD1被證明在神經(jīng)元分化過程中具有至關(guān)重要的作用[25]。本研究用Western blot檢測β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)水平，并用β-catenin抑制劑Dkk1抑制Wnt/β-catenin信號通路后檢測神經(jīng)元成熟的相關(guān)蛋白MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2，發(fā)現(xiàn)新生神經(jīng)元的成熟與Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，光遺傳學(xué)通過激活ChR2通道蛋白誘導(dǎo)膜電位產(chǎn)生動作電位促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟。體外誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟過程中Wnt/β-catenin信號發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究光遺傳學(xué)誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟治療TBI奠定基礎(chǔ)。