人參皂苷Rg2對慢性坐骨神經(jīng)損傷大鼠痛覺敏化和抑郁狀態(tài)的影響*

張巧蓮， 李雙英， 李 平

(中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學中心神經(jīng)內(nèi)科， 天津 3001062)

臨床上慢性疼痛患者常常伴有抑郁癥的發(fā)生，而部分抑郁癥患者也有慢性軀體疼痛癥狀[1]。因此，疼痛與抑郁發(fā)生之間的關(guān)系成為近來研究關(guān)注的問題[2-4]。研究表明，慢性疼痛可以誘導出抑郁相關(guān)行為。目前神經(jīng)痛的藥物治療僅能緩解癥狀，不能終止或逆轉(zhuǎn)外周神經(jīng)的損傷，并且劇烈的神經(jīng)痛對藥物的反應(yīng)不佳,雖然有足夠的資料支持阿片藥物的有效性，可與最好的可用的抗抑郁藥和抗驚厥藥相媲美，但由于阿片類藥物存在耐藥性及成癮性，因此對阿片藥物治療慢性神經(jīng)病理性疼痛仍存在廣泛爭議。人參皂苷Rg2具有神經(jīng)保護作用、抗缺血/再灌注損傷、抗凋亡和抗抑郁作用[5]，本研究通過建立大鼠慢性坐骨神經(jīng)損傷模型(chronic constriction injury, CCI)，通過腹腔注射給予人參皂苷Rg2，觀察藥物對CCI大鼠反映痛覺敏感的指標機械性縮足反射閾值和熱輻射縮足潛伏期以及反映焦慮、抑郁表現(xiàn)的指標明暗箱測試觀察大鼠在明箱內(nèi)時間、穿梭次數(shù)和強迫游泳實驗觀察大鼠游泳潛伏期、不動時間的影響，為神經(jīng)病理性疼痛的臨床治療提供新方案。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD 大鼠50只， 月齡(5～6) 月，體重(180～200) g，SPF級，出售單位為北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證為SKXK(京)2016-0006。人參皂苷Rg2(吉林省中醫(yī)中藥研究院)。電針儀(山東省醫(yī)學科學院設(shè)備廠，型號G6805-2)；光照測痛儀(山東省醫(yī)學科學院設(shè)備廠，型號YLS-12A)，明暗箱(MK-Animex，型號DSE)。

1.2 慢性坐骨神經(jīng)損傷模型[6]的建立

SD大鼠稱重，用2%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液腹腔注射3 ml/kg進行麻醉，用理發(fā)器剔除SD 大鼠右下肢毛發(fā)，碘酒消毒后，剪開皮膚，用玻璃分針充分暴露股后外側(cè)坐骨神經(jīng)干，在其分叉處開始，每間隔 1 mm，用 4 根 320 的鉻制羊腸線輕度結(jié)扎坐骨神經(jīng)，松緊度，以不影響坐骨神經(jīng)干的血液供應(yīng)為準，切口逐層縫合，然后用酒精將縫合皮膚表面血液擦拭干凈，肌肉注射青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎坐骨神經(jīng)外，其余操作與模型組一致。手術(shù)結(jié)束后，大鼠進行單籠飼養(yǎng)，以防咬傷，正常飲水攝食。

1.3 動物分組及處理

50只大鼠隨機分為5組(n=10)：(1)正常對照組( Normal+生理鹽水)；(2)假手術(shù)組(Sham+生理鹽水)：(3)坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷組(CCI+生理鹽水)；(4)人參皂苷Rg2低劑量治療組(CCI+Rg25 mg/kg)；(5)人參皂苷Rg2高劑量治療組(CCI+Rg210 mg/kg)，生理鹽水及Rg2均為腹腔注射。正常對照組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

1.4 觀察指標

手術(shù)前1 d 和手術(shù)第14日首先檢測各組大鼠的機械性縮足反射閾值、熱縮足潛伏期，然后進行明暗箱測試、強迫游泳實驗。手術(shù)后第 1、3、5、7、10日時檢測各組大鼠的機械性縮足反射閾值、熱縮足潛伏期。明暗箱測試觀察大鼠在明箱內(nèi)時間、穿梭次數(shù)；強迫游泳實驗觀察大鼠游泳潛伏期、不動時間。

1.4.1 機械性縮足反射閾值[7]測定 采用von Frey 細絲方法，將機械測痛儀放置在水平桌面上，實驗室內(nèi)溫度控制在(25±1)℃，保持安靜明亮的環(huán)境，實驗開始前將SD大鼠放置在儀器的有機玻璃箱中距離桌面約30 cm的金屬網(wǎng)架上，適應(yīng)10 min開始測量。刺激大鼠足底部選用不同的Von Frey 細絲，折力由小到大，足底部中央刺激部位保持各組一致，觀察大鼠縮足反應(yīng)的時間，即機械性縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)，每次測量間隔2～3 min，取 3 次測量的平均值作為觀察結(jié)果。

1.4.2 熱縮足潛伏期[8]測定 采用光照輻射刺激痛覺測試儀，實驗室內(nèi)溫度控制在(25±1)℃，儀器玻璃箱的溫度控制在37℃，保持安靜明亮的環(huán)境，實驗開始前將SD大鼠進行環(huán)境預(yù)適應(yīng)再開始實驗，將光源聚光后照射到SD大鼠足底部，觀察大鼠縮足反應(yīng)情況，當選定一定強度的光源，照射達到一定時間時，足底快速移開有機玻璃箱底面而出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，測定過程中保持有機玻璃箱底板干燥、清潔，以免影響測量結(jié)果，觀察和記錄由照射到SD大鼠出現(xiàn)縮足的時間作為熱縮足潛伏期(paw withdrawal thermal latency, PWL)， 設(shè)置最大光照時間為25 s，如25 s仍不縮足者記為熱縮足潛伏期為25 s，測量3次取平均值作為觀察結(jié)果。

1.4.3 明暗箱實驗 明暗箱檢測系統(tǒng)包括穿梭箱和記錄系統(tǒng)兩部分。穿梭箱分為3個不透明室，A室和B室較大，并排放置，為條件訓練室；C室較小，位于A室和B室前面，各室之間通過可以移動的門相通。A室為黑色室壁，B室為白色室壁，大鼠具有趨黑的特性，喜歡停留在A室內(nèi)，C室三壁透明可以用于適應(yīng)環(huán)境。圖像采集系統(tǒng)安裝在明暗箱頂部正中，并與計算機相連，可以追蹤觀察大鼠的活動情況，統(tǒng)計大鼠從明箱放入10 min，在明箱中的停留時間和穿梭次數(shù)。室溫控制在(25±1)℃，保持安靜明亮的環(huán)境。

1.4.4 強迫游泳實驗 大鼠游泳桶高度為60 cm，直徑為30 cm，保持加水深度為40 cm。水溫控制在(25±1)℃，保持安靜明亮的環(huán)境。將大鼠從固定位置放入游泳桶內(nèi)開始計時，記錄大鼠開始游泳的時間即游泳潛伏期以及從開始計時5 min內(nèi)的累積不動的時間。游泳5 min結(jié)束后，取出大鼠，用干紗布拭去皮膚毛發(fā)大部分水后，放回籠中飼養(yǎng)。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg2 對大鼠機械性縮足反射閾值的影響

各組大鼠手術(shù)前1 d至1 d機械性縮足反射閾值均在14 s左右，假手術(shù)組大鼠手術(shù)前與手術(shù)后機械性縮足反射閾值未見明顯變化，慢性坐骨神經(jīng)損傷模型組大鼠機械性縮足反射閾值手術(shù)后逐漸降低，7 d時最低，人參皂苷Rg2低、高劑量組與模型組相比，治療后3 d、7 d、14 d時械性縮足反射閾值顯著延長(P<0.01)，說明人參皂苷Rg2能抑制大鼠機械性疼痛，并且濃度越高，效果越明顯(表 1)。

2.2 人參皂苷Rg2對大鼠光輻射熱縮足反射潛伏期的影響

各組大鼠手術(shù)前1 d機械性縮足反射潛伏期均在21 s左右，假手術(shù)組大鼠手術(shù)前與手術(shù)后機械性縮足反射閾值未見明顯變化，慢性坐骨神經(jīng)損傷模型組大鼠機械性縮足反射閾值手術(shù)后逐漸降低，7 d時最低，人參皂苷Rg2低劑量組治療后7 d、14 d時，高劑量組3 d、7 d、14 d時與模型組相比，機械性縮足反射閾值明顯延長 (P<0.01)，說明人參皂苷Rg2能抑制大鼠機械性疼痛，并且濃度越高，效果越明顯(表2)。

2.3 人參皂苷Rg2對大鼠在明箱內(nèi)時間和穿梭次數(shù)的影響

各組大鼠手術(shù)前1 d在明箱內(nèi)時間和穿梭次數(shù)沒有顯著性差異，慢性坐骨神經(jīng)損傷模型組大鼠手術(shù)14 d時，與假手術(shù)組比較，在明箱內(nèi)時間顯著縮短(P<0.01)，在明箱內(nèi)穿梭次數(shù)顯著減少(P< 0.01)。人參皂苷Rg2低劑量組治療后手術(shù)14 d時，與模型組相比，在明箱內(nèi)時間顯著延長(P< 0.01)，穿梭次數(shù)明顯增加(P<0.01，表3)。

2.4 人參皂苷Rg2對大鼠游泳潛伏期和不動時間的影響

各組大鼠手術(shù)前1 d水中游泳潛伏期沒有顯著性差異，慢性坐骨神經(jīng)損傷模型組大鼠手術(shù)14 d時，與假手術(shù)組比較，水中游泳潛伏期顯著延長(P<0.01)。人參皂苷Rg2低劑量組治療后手術(shù)14 d時，與模型組相比，水中游泳潛伏期顯著縮短(P< 0.01)。各組大鼠手術(shù)前1 d手術(shù)第14日水中5 min內(nèi)不動時間沒有顯著性差異(P<0.01，表4)。

Tab. 1 Effects of ginsenoside Rg2 on the threshold of mechanical shrinkage foot reflex in rats (s, n=10)

**P<0.01vssham group or normal group;##P<0.01vsCCI group

Tab. 2 Effects of ginsenoside Rg2 on the thermal withdrawal latency in rats (s, n=10)

**P<0.01vssham group or normal group;##P<0.01vsCCI group

Tab. 3 Effects of ginsenoside Rg2 on the time in the light compartment and the number of transition of rats n=10)

**P<0.01vssham group or normal group;##P<0.01vsCCI group

Tab. 4 Effects of ginsenoside Rg2 on swimming latency and immobility time in rats(s, n=10)

**P<0.01vssham group or normal group;##P<0.01vsCCI group

3 討論

迄今為止，對神經(jīng)性病理性疼痛發(fā)病機制尚未完全闡明，臨床上屬于一種比較復雜的慢性疼痛，中藥在防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有多靶點、無耐藥性的優(yōu)點。人參皂苷Rg2作為人參中的主要有效成分，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面擁有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景[5]。 CCI 模型是最經(jīng)典的、最常用的疼痛模型，造模方法簡便、反映穩(wěn)定，其疼痛特征和神經(jīng)病理性疼痛十分相似，可表現(xiàn)出自發(fā)痛、觸發(fā)痛等痛覺過敏[9]。本實驗建立的大鼠CCI模型，手術(shù)后1～14 d時，機械性疼痛閾值和光照輻射熱疼痛潛伏期與假手術(shù)組比較均明顯縮短。

在臨床上慢性疼痛患者常常伴隨焦慮、抑郁等情緒。抑郁狀態(tài)可以縮短機體對疼痛反應(yīng)的閾值，慢性疼痛可以誘發(fā)抑郁行為。通過慢性應(yīng)激的方法建立的抑郁模型大鼠對甲醛誘導的自發(fā)性疼痛更加敏感，同時抗抑郁藥物能夠改善其痛覺過敏。慢性刺激誘導的抑郁狀態(tài)能夠加劇大鼠對疼痛反應(yīng)的敏感性[10]。葉永賢等研究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)結(jié)扎的大鼠表現(xiàn)為持續(xù)熱痛閾縮短，明箱內(nèi)停留時間縮短、穿梭次數(shù)減少，強迫游泳潛伏期延長[11]。但也有研究發(fā)現(xiàn)破壞調(diào)控痛情緒的高級中樞脊髓上中樞的前扣帶皮層可以改善疼痛情緒方面的反應(yīng)，而不能改變急性疼痛的痛覺行為[12]。本研究采用明暗箱測試和強迫游泳試驗同時觀察了CCI模型的焦慮、抑郁等情緒變化情況，發(fā)現(xiàn)CCI手術(shù)后14 d大鼠同時具有焦慮、抑郁的表現(xiàn)。中藥治療抑郁癥，具有不良反應(yīng)少、可長期服用、安全可靠等優(yōu)點。2017 年， Ren 等[13]首次證明了人參皂苷Rg2 與氟西汀類似對小鼠具有抗抑郁作用。其作用機制可能是通過上調(diào)海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)信號通路發(fā)揮作用。研究通過強迫游泳試驗、尾部懸吊試驗和蔗糖偏好試驗三種行為學測試結(jié)果表明，人參皂苷Rg2 確實具有抗抑郁效果。此外，Western印跡分析顯示，人參皂苷Rg2 可增加海馬中的BDNF信號傳導途徑。

腹腔腸系膜面積大、血管和淋巴管分布豐富，吸收能力強。不同給藥途徑對各種疼痛的臨床治療效果不同，SD大鼠選擇腹腔注射給藥，藥物吸收快，容易達到藥物治療濃度，而且實驗操作比較方便[14-15]。本研究結(jié)果顯示，腹腔注射人參皂苷Rg2能夠延長CCI模型大鼠機械性縮足反射閾值和熱縮足潛伏期，同時也能緩解CCI大鼠的焦慮、抑郁狀態(tài)。

疼痛常伴隨抑郁狀態(tài)，疼痛治療的同時要關(guān)注抑郁指標的變化，關(guān)鍵時刻可以考慮選擇性的使用抑郁藥物進行綜合治療。綜合的心理及藥物干預(yù)將有助于闡明痛覺的調(diào)控機制，從而指導疼痛的臨床治療。