邵婷婷,張敏,2,3,4*,劉威,姜雪,趙昱瑄,郝爽,厲建國(guó),盧瑛
1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái),上海,201306) 4(食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)),上海,201306)
青椒果實(shí)由于其自身的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受廣大消費(fèi)者的青睞。由于青椒果實(shí)原產(chǎn)于南美,是一種季節(jié)性較強(qiáng)的呼吸躍變型冷敏果蔬,采摘之后在常溫下不易貯藏,極易失水萎蔫、腐敗變質(zhì),使其外觀品質(zhì)和貯藏性大大降低,因此青椒的貯藏保鮮就顯得尤為重要。目前人們大多數(shù)采用低溫貯藏的方式來(lái)延長(zhǎng)其貯藏期限,但在低溫貯藏時(shí),青椒果實(shí)由于其冷敏性的特點(diǎn)極易受到冷害而導(dǎo)致其可食用價(jià)值和商品價(jià)值大大降低,并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中冷害是指高于0 ℃的低溫對(duì)產(chǎn)自于熱帶、亞熱帶的果實(shí)造成的生理代謝失調(diào)和組織傷害[1-2]。青椒果實(shí)的適宜貯藏溫度為(7~9) ℃[3-6],當(dāng)青椒的貯藏溫度低于這個(gè)溫度范圍時(shí)就會(huì)出現(xiàn)冷害現(xiàn)象。由于冷害現(xiàn)象的發(fā)生,使得低溫運(yùn)輸及貯藏受到了一定的限制。因此,需要找到適當(dāng)?shù)馁A前處理方式來(lái)解決這一問(wèn)題。有關(guān)青椒果實(shí)的貯前處理方式常見的有化學(xué)保鮮劑處理、涂膜處理、天然提取物處理以及熱處理等方式[7]。其中熱激處理技術(shù)結(jié)合低溫貯藏的方式對(duì)保持果蔬品質(zhì)新鮮,延長(zhǎng)貯藏期很有效,有著很好的應(yīng)用前景[8-17]。在常見的熱處理方式中,短時(shí)間的熱水浸泡處理被認(rèn)為是最有效的熱處理方式[18]。但目前關(guān)于同一有效熱水處理溫度下不同處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)低溫貯藏期間的活性氧代謝及抗氧化系統(tǒng)的影響之間的研究還未有人涉及。本次試驗(yàn)研究同一熱水處理溫度下不同的熱水處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)的活性氧代謝和抗氧化物質(zhì)的變化情況,以期為青椒果實(shí)貯藏保鮮的進(jìn)一步研究提供參考。
青椒:選用“洛椒”青椒作為試驗(yàn)材料,于2018 年6月 4日采于上海市南匯新城鎮(zhèn)果園,裝于泡沫箱中當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。
鹽酸羥胺、Na2HPO4、乙二胺四乙酸、對(duì)氨基苯磺酸、α-萘胺、DTT、三氯乙酸、二硫代硝基苯甲酸、還原性谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、硫代巴比妥酸(分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
BPS-100CA型恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;H-2050R-1型高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司; THZ-82A型恒溫振蕩箱,江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;BJ2100D型數(shù)字孔式電子天平,臺(tái)灣精達(dá)電子儀器有限公司;DDS-307型電導(dǎo)率儀,上海笛柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HSWX-600BS型電熱恒溫水溫箱,上海圣科儀器設(shè)備有限公司。
1.3.1 青椒預(yù)處理
挑選大小一致、形狀規(guī)整、果皮堅(jiān)硬有光澤、無(wú)明顯機(jī)械損傷、無(wú)病蟲害的新鮮青椒果實(shí)裝于泡沫箱中當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。果實(shí)平均長(zhǎng)度為14~17 cm,平均質(zhì)量為60~90 g。將青椒果實(shí)清洗干凈后拭干備用。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果,選取有效熱水處理溫度為44 ℃,來(lái)研究該溫度下處理青椒果實(shí)2、7、12、17和22 min,另外不經(jīng)過(guò)熱水處理的設(shè)為對(duì)照組,進(jìn)而研究不同的熱水處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)的低溫貯藏期間細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝及抗氧化物質(zhì)的影響。將各組青椒果實(shí)處理后放于干凈的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上晾干再裝入厚度為0.03 mm的聚乙烯保鮮袋,最后放于(4±0.5) ℃相對(duì)濕度為(80±5)%的冷庫(kù)中貯藏,整個(gè)貯藏周期為21 d,每隔2 d取出青椒樣品觀察各組的冷害指數(shù)并測(cè)定其他各項(xiàng)品質(zhì)及生理生化指標(biāo),重復(fù)3次。
1.3.2 品質(zhì)指標(biāo)與測(cè)定方法
(1)冷害指數(shù)的測(cè)定
冷害指數(shù)是評(píng)價(jià)果蔬冷害程度很直觀的一個(gè)指標(biāo)。參照侯建設(shè)等[19]的方法來(lái)對(duì)青椒果實(shí)的冷害指數(shù)進(jìn)行評(píng)定。通過(guò)觀察青椒果實(shí)果面所呈現(xiàn)出的冷害面積將冷害癥狀分為4級(jí)。其中,0級(jí):無(wú)冷害癥狀;1級(jí):輕微冷害,冷害斑不超過(guò)果面的10%;2級(jí):中度冷害,冷害斑占果面積的10%~40%;4級(jí):嚴(yán)重冷害,冷害斑超過(guò)果面的40%。
(1)
(2)失重率的測(cè)定
在貯藏前用電子天平將每個(gè)新鮮青椒果實(shí)稱重并記為G0,將青椒從冷庫(kù)中取出后置于干凈的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上并用紙拭干,再用電子天平稱重并記為G。每組青椒稱重之后再將其放入新的厚度為0.03 mm的聚乙烯保鮮袋(打若干個(gè)1 cm的孔)中于冷庫(kù)中貯藏。用公式(2)計(jì)算出青椒的失重率。
(2)
(3)電解質(zhì)外滲率的測(cè)定
參考陳健華等[20-21]的測(cè)定方法,稍作修改,用DDS-307電導(dǎo)率儀測(cè)定。選取較為平整的青椒果面,用打孔器取10個(gè)圓片放入有編號(hào)的燒杯中,并添加20 mL去離子水后將燒杯放于轉(zhuǎn)速為150 r/min,環(huán)境溫度為25 ℃的恒溫振蕩箱(THZ-82A,江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)內(nèi)振蕩10 min,振蕩后取出燒杯并用去離子水反復(fù)沖洗3次,用濾紙將青椒圓片表面的水分拭干,把圓片再次放入燒杯中,重新加入20 mL去離子水,測(cè)定此時(shí)的電導(dǎo)率值,并記為Ro。測(cè)定結(jié)束后把燒杯放于真空干燥器(規(guī)格:240 mm,上海帥登儀器有限公司)中60 min。之后取出燒杯再次放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩1 h,振蕩結(jié)束后取出測(cè)定此時(shí)的電導(dǎo)率并記為R。用保鮮膜覆于燒杯上并把燒杯于沸水中煮沸10 min,煮沸結(jié)束后靜待恢復(fù)至室溫,測(cè)定此時(shí)的電導(dǎo)率R′。記錄試驗(yàn)結(jié)果,并用公式(3)來(lái)算出電導(dǎo)率。
(3)
(4)丙二醛含量的測(cè)定
MDA含量測(cè)定分光光度計(jì)分別測(cè)定450、532和600 nm的吸光值,并利用公式(4)計(jì)算測(cè)定青椒果實(shí)的MDA含量。
c/(μmol·L-1)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450
(4)
(6)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定
CAT在催化H2O2分解成為水和分子氧的過(guò)程中,起到電子傳遞的作用,因此,可根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中H2O2的消耗量來(lái)測(cè)定該酶的活性。H2O2在波長(zhǎng)240 nm 處具有吸收峰,利用分光光度計(jì)可以檢測(cè)H2O2含量的變化。其中CAT活性測(cè)定以每克果肉1 min 內(nèi)OD240值變化0.01為1個(gè)酶活單位。
(7)谷胱甘肽還原酶(GR)活性的測(cè)試
在還原型輔酶(NADPH)提供氫的條件下,GR能將氧化性谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH),同時(shí)NADPH形成NADP+。NADPH在波長(zhǎng)340 nm處具有吸收峰,因此可以通過(guò)測(cè)定OD340的減小來(lái)計(jì)算GR的活性。反應(yīng)系統(tǒng)中每分鐘OD340變化0.1為1個(gè)酶活性單位。
(8)還原型谷胱甘肽(GSH)的測(cè)定
谷胱甘肽是一種天然三肽,能和二硫代硝基苯甲酸產(chǎn)生一種黃色物質(zhì),該物質(zhì)在波長(zhǎng)412 nm處具有最大光吸收,因此利用分光光度計(jì)法可測(cè)定青椒果實(shí)中GSH的含量。
1.3.3 數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理,SPSS 19.0 軟件繪圖進(jìn)行差異性分析。本文所有試驗(yàn)為3次重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
冷害指數(shù)是評(píng)價(jià)果蔬細(xì)胞冷害情況的一個(gè)很直觀、很重要的指標(biāo),可以直接反映出果蔬遭受低溫冷害的程度[23]。在青椒果實(shí)的整個(gè)低溫貯藏期間,由于青椒果實(shí)所處的環(huán)境溫度低于其冷害發(fā)生的臨界溫度[24],所以隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),各組青椒果實(shí)的冷害癥狀就逐漸顯現(xiàn),但不同處理組的青椒果實(shí)的冷害發(fā)生時(shí)間以及冷害程度又有所差別。由圖1可以看出,各組冷害發(fā)生時(shí)間先后順序?yàn)镃K=22 min=17 min =7 min>2 min>12 min。
圖1 不同熱處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)冷害指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different heat treatment time on cold damage index of green pepper fruits
隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),各組青椒果實(shí)的冷害癥狀之間的差別就愈加明顯。貯藏到12 d時(shí),44 ℃熱水處理12 min組青椒果實(shí)剛開始出現(xiàn)冷害癥狀,其值為12.5%,而2、7、17、22 min以及CK組的冷害指數(shù)分別為25%、43.8%、40.6%、41.7%和53.1%。在整個(gè)低溫貯藏期間,12 min處理組青椒果實(shí)的冷害指數(shù)一直都維持在較低水平,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他處理組,到貯藏結(jié)束時(shí),12 min處理組青椒果實(shí)的冷害指數(shù)僅為對(duì)照組的36%。而其他各處理組青椒果實(shí)的冷害指數(shù)在貯藏后期都有大幅度的增加,其中 2、7、12、17、22 min和CK組青椒果實(shí)的冷害指數(shù)分別達(dá)到了37.5%、54.2%、59.4%、62.5%和68.9%,均顯著高于12 min組的冷害指數(shù)25%(P<0.05)。可能是因?yàn)樵谫A藏初期的青椒果實(shí)冷害癥狀不是很明顯,隨著低溫貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),各組青椒果實(shí)的冷害癥狀才隨之加劇,而12 min組青椒果實(shí)較低的冷害指數(shù)則說(shuō)明該條件可以有效減輕青椒的冷害癥狀。
新鮮的青椒果實(shí)果肉較厚且含水量較高,具有很好的外觀品質(zhì)以及很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但采摘后的青椒果實(shí)為了延長(zhǎng)貯藏期常將其貯于低溫環(huán)境中。處于低溫環(huán)境下的青椒果實(shí)由于受到低溫逆境的傷害難免會(huì)出現(xiàn)失水皺縮、果皮變軟等現(xiàn)象。如圖2所示,隨著低溫貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),由于不同熱水處理時(shí)間下的青椒果實(shí)都有一定程度的失水現(xiàn)象,所以青椒果實(shí)的失重率呈現(xiàn)出一直上升的趨勢(shì),但不同處理組下青椒果實(shí)的失重率的上升情況差異也較明顯。
圖2 不同熱處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)失重率的影響Fig.2 Effects of different heat treatment time on weight loss rate of green pepper fruits
在整個(gè)低溫貯藏期間,各個(gè)熱處理組青椒果實(shí)的失重率都始終低于對(duì)照組,但22 min處理和對(duì)照組青椒果實(shí)的失重率接近,二者之間無(wú)顯著性差異。第9天時(shí),12 min組青椒果實(shí)的失重率僅為0.95%,而22 min組和CK組已經(jīng)分別達(dá)到了2.91%和3.07%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于12 min處理組。對(duì)于2、7和17 min處理組青椒果實(shí)的失重率來(lái)說(shuō),其數(shù)值也高于12 min處理組。該結(jié)果說(shuō)明熱水處理時(shí)間較長(zhǎng)或較短都不能很好達(dá)到抑制失重率增加的效果,12 min處理可以增強(qiáng)青椒果實(shí)在低溫貯藏期間的抗逆性,進(jìn)而抑制其失重率的大幅度增加,使青椒果實(shí)的失重率維持在較低的水平,有利于青椒果實(shí)的進(jìn)一步貯藏。
采后的青椒果實(shí)在低溫貯藏時(shí)因?yàn)樵馐芰说蜏啬婢车膫Γ浼?xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),進(jìn)而造成青椒果實(shí)細(xì)胞膜的膜脂狀態(tài)發(fā)生改變,減弱了膜脂分離的流動(dòng)性,改變了原生質(zhì)內(nèi)部的隔離狀態(tài),使得青椒果實(shí)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜透性增加,細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞,從而導(dǎo)致果實(shí)軟化腐爛[25-26]。LYONS[27]研究得出果蔬細(xì)胞在處于低溫逆境中時(shí),最先受到影響的就是生物細(xì)胞膜當(dāng)中的組成成分的狀態(tài)。因此,電解質(zhì)外滲率這一指標(biāo)其值越高,說(shuō)明果蔬細(xì)胞的細(xì)胞膜受損害的程度就越嚴(yán)重[28]。由圖3可知,各處理組青椒果實(shí)的電解質(zhì)外滲率均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,這說(shuō)明各組青椒果實(shí)細(xì)胞均受到了不同程度的傷害,膜脂狀態(tài)也發(fā)生了一定程度的改變,進(jìn)而體現(xiàn)在電解質(zhì)外滲率數(shù)值的變化。不同處理組青椒果實(shí)的電解質(zhì)外滲率增加的幅度不同,說(shuō)明各處理組下的青椒果實(shí)對(duì)逆境的抗性不同。對(duì)于12 min處理組的青椒果實(shí)來(lái)說(shuō),其電解質(zhì)外滲率一直維持在一個(gè)較低的水平,說(shuō)明該處理組下的青椒果實(shí)在低溫逆境下有了很好的抗性,進(jìn)而能夠保護(hù)細(xì)胞的膜脂狀態(tài),減少細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲漏,維持了較低的電解質(zhì)外滲率值。在貯藏前期,其他各組青椒果實(shí)的電解質(zhì)外滲率都有一個(gè)明顯的上升過(guò)程,而12 min青椒果實(shí)的電解質(zhì)外滲率值僅增加了3%。12 min處理組青椒果實(shí)在21 d時(shí)其電解質(zhì)外滲率的數(shù)值僅為54%,是對(duì)照組青椒果實(shí)電解質(zhì)外滲率的78%。而22 min處理組青椒果實(shí)的電解質(zhì)外滲率在貯藏結(jié)束時(shí)甚至達(dá)到了70%,稍高于對(duì)照組青椒果實(shí)的電解質(zhì)外滲率。出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的熱水處理使青椒果實(shí)細(xì)胞在應(yīng)對(duì)低溫逆境時(shí)的抗性減小。在整個(gè)低溫貯藏期間,12 min處理組的青椒果實(shí)的細(xì)胞膜完整性維持的最好,該處理組下的青椒果實(shí)的抗性高于其他各組(圖3)。
圖3 不同熱處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)電解質(zhì)外滲率的影響Fig.3 Effect of different heat treatment time on electrolyte extravasation rate of green pepper fruit
膜脂過(guò)氧化現(xiàn)象就是指細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)骨架磷脂分子被氧化,生成過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛,丙二醛的累積會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性[29]。由圖4可知,在貯藏前期,各處理組青椒果實(shí)的丙二醛含量均出現(xiàn)了一個(gè)輕微的下降過(guò)程,從第6天開始一直到低溫貯藏結(jié)束,各組青椒果實(shí)的丙二醛含量均持續(xù)增加,且不同處理組下的青椒果實(shí)丙二醛含量也呈現(xiàn)出來(lái)不同的增加幅度。各個(gè)處理組當(dāng)中,增加幅度最明顯的為對(duì)照組,其數(shù)值由貯藏初期的0.000 32 μmol/g增加到0.002 μmol/g。增加幅度最小的是12 min處理組,在貯藏結(jié)束時(shí),其數(shù)值為0.001 μmol/g,明顯小于其他各處理組(P<0.05)。且在貯藏后期,各組青椒果實(shí)的丙二醛含量增加的幅度比前期要高,這可能是由于長(zhǎng)期的處于低溫逆境中青椒果實(shí)內(nèi)的膜脂過(guò)氧化反應(yīng)加劇,使得丙二醛大量積累。青椒果實(shí)細(xì)胞內(nèi)的丙二醛含量的變化跟電解質(zhì)外滲率這一指標(biāo)之間有著一定的聯(lián)系。因?yàn)檫@兩種指標(biāo)的變化都跟青椒果實(shí)細(xì)胞的細(xì)胞膜膜脂狀態(tài)的改變有關(guān)。當(dāng)青椒果實(shí)處于低溫環(huán)境中時(shí),其細(xì)胞膜的完整性受到破壞,加之細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化反應(yīng)的進(jìn)行,過(guò)氧化產(chǎn)物的積累使得青椒果實(shí)的抗逆性減弱。由結(jié)果可知,12 min熱水處理組使青椒果實(shí)的丙二醛含量維持在一個(gè)較低的水平,表明該處理?xiàng)l件下的青椒果實(shí)細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化程度較低,細(xì)胞所受的逆境傷害最小。
圖4 不同熱處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)MDA含量的影響Fig.4 Effect of different heat treatment time on MDA content of green pepper fruit
圖5 不同熱處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)產(chǎn)生速率的影響Fig.5 Effect of different heat treatment time on production rate of green pepper fruit
CAT分解H2O2生成H2O和O2分子,能夠有效地清除自由基。不同熱水處理時(shí)間青椒果實(shí)的CAT酶活性的變化如圖6所示。
圖6 不同熱處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)CAT活性的影響Fig.6 Effects of different heat treatment time on CAT activity of green pepper fruits
結(jié)果表明,CAT酶活性呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。由各組青椒果實(shí)在整個(gè)低溫貯藏期間CAT的活性變化可知,各組CAT活性均在第9天達(dá)到峰值,隨后則下降。各處理組青椒果實(shí)CAT活性的峰值分別為5.37、4.52、6.91、 5.25、5.24和4.58 U/(g·min)。由圖6可以看出,12 min處理組青椒果實(shí)的CAT活性一直高于其他各組,即使到了貯藏后期,12 min處理組青椒果實(shí)的CAT活性雖然有所降低,但降低的幅度卻維持在較低的水平,貯藏到第21天時(shí),12 min處理組青椒果實(shí)的CAT活性仍然高達(dá)4.21 U/(g·min),為對(duì)照組的1.91倍。CAT酶活性的變化趨勢(shì)反映了青椒果實(shí)細(xì)胞內(nèi)的活性氧清除水平。12 min組青椒果實(shí)的CAT活性一直高于其他處理組,說(shuō)明該處理?xiàng)l件下的青椒果實(shí)的活性氧代謝維持在較低的水平,細(xì)胞受活性氧物質(zhì)的傷害程度最小。因此,12 min處理下的青椒果實(shí)清除活性氧的能力處在一個(gè)較高的水平,提高了青椒果實(shí)在低溫期間對(duì)逆境的抗性,增加了細(xì)胞的自我保護(hù)能力。
圖7 不同熱處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)GR活性的影響Fig.7 Effects of different heat treatment time on GR activity of green pepper fruits
12 min處理組青椒果實(shí)的GR活性一直高于其他各組。在第9天時(shí)各組青椒果實(shí)的GR均達(dá)到峰值,其中12 min處理組青椒果實(shí)的GR活性高達(dá)29.85 U/mg,其他各組青椒果實(shí)的GR活性除了17 min組的為21.75 U/mg外,其他各組均低于20 U/mg。各組青椒果實(shí)的GR活性不僅是峰值大小的差別,即使在貯藏結(jié)束時(shí),12 min處理組青椒的GR活性仍然較高,維持在15.64 U/mg,是對(duì)照組的2.72倍。青椒果實(shí)在低溫貯藏期間由于受到低溫逆境的影響,其細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的活性氧代謝,此時(shí)青椒果實(shí)細(xì)胞中的GR就會(huì)保持一種較高的活性來(lái)應(yīng)對(duì),由上述結(jié)果可知,12 min處理組的青椒果實(shí)的GR的活性較高,對(duì)青椒細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧起到了很好的清除作用,降低了青椒果實(shí)低溫貯藏期間的逆境傷害,是一種很好的熱處理?xiàng)l件。
圖8 不同熱處理時(shí)間對(duì)青椒果實(shí)GSH含量的影響Fig.8 Effects of different heat treatment time on GSH content of green pepper fruits