袁芳，史永華

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，新疆 烏魯木齊 830011）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1]。宮頸癌患者一個(gè)重要的臨床病理特點(diǎn)是常合并長期慢性宮頸炎并伴隨組織水腫。水腫是病變組織水代謝紊亂的外在表現(xiàn)，而其內(nèi)在原因可能與水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）功能異常關(guān)系密切。AQPs 是一組跨細(xì)胞質(zhì)膜由滲透壓驅(qū)動(dòng)選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的小而完整的糖蛋白，廣泛存在于活細(xì)胞內(nèi)，主要參與各種涉及水代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)的生理病理過程[2]。研究表明，AQPs 廣泛參與惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等過程[3-4]。

在慢性炎癥向癌癥的轉(zhuǎn)化過程中，缺氧、持續(xù)性炎癥等應(yīng)激性微環(huán)境引起組織水腫，活性氧（reactive oxygen species,ROS）尤其過氧化氫H2O2不斷產(chǎn)生。新近研究報(bào)道，AQPs 的某些亞型不僅能夠跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)H2O2[5]。目前有關(guān)應(yīng)激性微環(huán)境中H2O2的異常與AQPs 在惡性腫瘤特別是宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用文獻(xiàn)報(bào)道極少，其具體的分子機(jī)制更是鮮有報(bào)道。本研究初步探討AQP3 和腫瘤微環(huán)境中H2O2的關(guān)系及其對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖、遷移的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

HeLa 細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存），pLVshRNA-EGFP （2A）Puro-shRNA 干擾雙標(biāo)RNAi 慢病毒載體（VL3103，北京Inovogen 公司），慢病毒包裝系統(tǒng)（12260，12259，美國Addgene 公司），質(zhì)粒抽提試劑盒（D6915，美國Omega Bio-Tek 公司），AQP3 一抗（ab125219，英國Abcam 公司），ROS 檢測(cè)試劑盒（含綠色熒光探針DCFH-DA 和高純度H2O2，E004，南京建成生物工程所），cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622，美國Fermentas 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌HeLa（人子宮頸腺癌細(xì)胞，HPV18 陽性）培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、青/鏈霉素（10 萬u/L），于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 AQP3 shRNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞系的構(gòu)建

1.3.1 構(gòu)建pLVshRNA-EGFP（2A）Puro-shRNA-AQP3 重組質(zhì)粒根據(jù)GenBank 中AQP3基因mRNA 序列（NM_004925），設(shè)計(jì)3 對(duì)siRNA 片段：AQP3-homo-464 （正向5'-GGGCUGUAUUAUGAUGCAATT-3'，反向5'-U UGCAUCAUAAUACAGCCCTT-3'）、AQP3-homo-198 （正向5'-CCCUCAUCCUGGUGAUGUUTT-3'，反向5'-A ACAUCACCAGGAUGAGGGTT-3'）、AQP3-homo-612（正向5'-CCCUUAUCGUGUGUGUGCUTT-3'，反向5'-AGCACACACACGAUAAGGGTT-3'）。用LipofectamineTM2000 分別轉(zhuǎn)染3 組siRNA 到293T 細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后做實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測(cè)篩選干擾效應(yīng)明顯的干擾片段。選擇pLV shRNA-EGFP（2A）PuroshRNA 雙標(biāo)干擾載體，設(shè)計(jì)2 對(duì)shRNA：shRNA-464（正向5'-GATCCGGGCTGTATTATGATGCAATCAAGA GTTGCATCATAATACAGCCCTTTTTTG-3'，反向5'-AA TTCAAAAAAGGGCTGTATTATGATGCAACTCTTGATTG CATCATAATACAGCCCG-3'）和shRNA-612（正向5'-G ATCCCCCTTATCGTGTGTGTGCTTCAAGAGAGCACAC ACACGATAAGGGTTTTTTG-3'，反向5'-AATTCAAAA AACCCTTATCGTGTGTGTGCTCTCTTGAAGCACACAC ACGATAAGGGG-3'），退火片段與酶切后的載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆搖菌及PCR鑒定菌液，選取陽性菌液測(cè)序并經(jīng)BLAST 比對(duì)證實(shí)。

1.3.2 慢病毒包裝及生物學(xué)滴度測(cè)定接種293T 細(xì)胞于6 cm 培養(yǎng)皿中，1×105個(gè)/ml。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將慢病毒包裝質(zhì)粒和目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中。收集轉(zhuǎn)染48 h 培養(yǎng)上清液，離心、過濾，進(jìn)行滴度測(cè)定，測(cè)定結(jié)果滴度較高，可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。病毒置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.3.3 慢病毒感染細(xì)胞及嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系接種HeLa 細(xì)胞于6 孔板，5×105個(gè)/孔，按復(fù)感染指數(shù)（multiplicity of infection,MOI）=10 加入慢病毒。400 ng/ml 嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，Western blotting檢測(cè)。

1.4 H2O2 誘導(dǎo)前后宮頸癌HeLa 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞，胰酶消化，以5×105個(gè)/ml 接種于6 孔板，2 ml/孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞至匯合70.0%～80.0%，100 μmol/L H2O2的完全培養(yǎng)基作用6 h，更換10 μmol/L DCFH-DA 37℃孵育30 min，消化、收集細(xì)胞，激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)代表ROS（主要為H2O2）水平的綠色熒光強(qiáng)度。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

CCK-8 法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組（HeLa-AQP3-464 shRNA）和對(duì)照組[HeLa、HeLa（-）]宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖情況。選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化并計(jì)數(shù)，應(yīng)用96 孔板，2 000 個(gè)/孔、培養(yǎng)液200 μl/孔，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，24 h 后每孔分別加入0、5、10、20 及50 μmol/L H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后加入CCK-8 10 μl/孔，加入無血清培養(yǎng)基90 μl/孔，37℃孵育2.5 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度（A）值。

1.6 細(xì)胞損傷愈合實(shí)驗(yàn)

不同組細(xì)胞分別以1×106個(gè)/孔接種在6 孔板中，24 h 后細(xì)胞培養(yǎng)至單層匯合狀態(tài)時(shí)用含1% FBS的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞同步化24 h。用10 μl 無菌移液頭尖端于培養(yǎng)板垂直方向輕輕劃過細(xì)胞層，形成寬度為300～500 μm的無細(xì)胞劃痕區(qū)。PBS洗3次，加入含10% FBS 的完全培養(yǎng)基、H2O210 μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0和24 h倒置顯微鏡下照相，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.7 Western blotting 檢測(cè)

細(xì)胞接種于6 孔板24 h 后，100 ng/ml 表皮生長因子（EGF）刺 激10 min 后 用200 μmol/L H2O2作用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞各20 min，收集細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞裂解液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液30 μl，加入4×loading buffer 10 μl，95℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，12 000 r/min 離心1 min，取上清液。利用BCA 試劑盒測(cè)定樣品蛋白含量。取測(cè)定樣品，每孔上樣量為20 μg，8% SDS-PAGE 電泳分離：濃縮膠電泳80 V 30 min，分離電泳120 V 70 min，然后電壓80 V 下轉(zhuǎn)至PVDF 膜。封閉液封閉1 h，加蛋白激酶B（PKB）、磷酸化蛋白激酶B（p-PKB）一抗，4℃過夜，PBST 洗3 次，10 min/次；加二抗，室溫孵育1 h，PBST 洗3 次，10 min/次。用ECL 底物完成化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，顯影、定影后采用掃描儀掃描，數(shù)據(jù)傳輸?shù)紾el Proanalyzer 軟件中完成灰度分析定量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較行Student'st檢驗(yàn)或單因素方差分析（Dunnett's 多重比較檢驗(yàn)），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒pLV shRNA-EGFP（2A）Puro-shRNA-AQP3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞系

設(shè)計(jì)的3 對(duì)干擾片段經(jīng)qRT-PCR 檢測(cè)篩選出AQP3 mRNA 表達(dá)相對(duì)較低的片段464 和612（見圖1A）；選 擇pLVshRNA-EGFP（2A）Puro-shRNA 雙標(biāo)干擾載體，設(shè)計(jì)AQP3-464-shRNA 和AQP3-612-shRNA，連接轉(zhuǎn)化后，細(xì)菌的陽性克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，證實(shí)構(gòu)建的干擾質(zhì)粒AQP3-464-shRNA 和AQP3-612-shRNA 正確（見圖1B），并經(jīng)測(cè)序比對(duì)證實(shí)。選擇干擾質(zhì)粒AQP3-464-shRNA 病毒液穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞，經(jīng)Western blotting 分析驗(yàn)證，HeLa、HeLa（-）、HeLa-AQP3-464 shRNA 細(xì)胞中AQP3/GAPDH 的相對(duì)表達(dá)分別為（1.00±0.02）、（1.04±0.04）和（0.63±0.08），重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞后在蛋白水平抑制AQP3 的表達(dá)（見圖2A、B）。

2.2 AQP3 shRNA 抑制HeLa 細(xì)胞中H2O2 的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)

激光共聚焦結(jié)果顯示，與HeLa、HeLa（-）比較，HeLa-AQP3-464-shRNA 細(xì)胞內(nèi)代表ROS（主要為H2O2）水平的綠色熒光變?nèi)酰珹QP3 shRNA 抑制H2O2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。見圖3。

圖1 重組質(zhì)粒pLV shRNA-EGFP（2A）Puro-shRNA-AQP3 的構(gòu)建

2.3 AQP3 shRNA 介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中H2O2 轉(zhuǎn)運(yùn)抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞的增殖

結(jié)果表明，低濃度H2O2（10 μmol/L）促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖，AQP3 shRNA 抑制腫瘤微環(huán)境中H2O2轉(zhuǎn)運(yùn)從而抑制HeLa 細(xì)胞增殖，20 μmol/L 以上高濃度H2O2則顯示出細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖4A。

細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示，低濃度H2O2（5 或10 μmol/L）分別加入不同組細(xì)胞培養(yǎng)10 d，至出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。與HeLa、HeLa（-）比較，HeLa-AQP3-464-shRNA 組細(xì)胞克隆形成減少（見圖4B），該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)CCK-8 結(jié)果。

圖2 重組質(zhì)粒pLV shRNA-EGFP（2A）Puro-shRNA-AQP3 的鑒定

圖3 H2O2 處理后不同組別HeLa 細(xì)胞內(nèi)的H2O2 變化 （激光共聚焦×200）

2.4 AQP3 shRNA 介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中H2O2 轉(zhuǎn)運(yùn)抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞遷移

10 μmol/L H2O2作用于HeLa、HeLa（-）、HeLa-AQP3-464-shRNA 細(xì)胞24 h 后，其平均愈合速度分別為（296.91±88.86）、（309.02±11.25）和（223.46±12.94）μm。HeLa-AQP3-464-shRNA 與HeLa、HeLa（-）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.300，P=0.000）。見圖5、6。

2.5 AQP3 shRNA 介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中H2O2 轉(zhuǎn)運(yùn)抑制下游信號(hào)PKB 的激活

在H2O2分別為0 和200 μmol 時(shí)，HeLa 組p-PKB的相對(duì)表達(dá)為（0.20±0.087）、（0.58±0.041），HeLa（-）組p-PKB的相對(duì)表達(dá)為（0.390±0.055）、（0.430±0.068），HeLa-AQP3-shRNA 組p-PKB 的相對(duì)表達(dá)為（0.480±0.067）、（0.790±0.043）。在200 μmol H2O2作用后各組內(nèi)的p-PKB 變化均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但HeLa-AQP3-shRNA組與HeLa組比較，p-PKB 變化幅度?。‵=634.900，P=0.000）。見圖7、8。

圖4 AQP3-shRNA 介導(dǎo)H2O2 轉(zhuǎn)運(yùn)抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞的增殖

圖5 10 μmol/L H2O2 處理后不同組別HeLa 細(xì)胞的遷移

圖6 10 μmol/L H2O2 處理后不同組別HeLa 細(xì)胞的 平均愈合速度 （±s）

圖7 AQP3 介導(dǎo)H2O2 轉(zhuǎn)運(yùn)抑制PKB 的激活

圖8 AQP3 介導(dǎo)H2O2 轉(zhuǎn)運(yùn)抑制PKB 激活的 灰度掃描量化結(jié)果 （±s）

3 討論

本研究成功構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的AQP3 shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa 細(xì)胞株，并經(jīng)測(cè)序比對(duì)證實(shí)，重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞后在蛋白水平抑制AQP3 的表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)，抑制HeLa 細(xì)胞中AQP3 的表達(dá)可減少細(xì)胞內(nèi)ROS（主要為H2O2）水平，提示AQP3 可跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)H2O2。筆者進(jìn)一步研究AQP3 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)H2O2對(duì)HeLa 細(xì)胞相關(guān)表型如增殖、遷移的作用。CCK-8 和細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的H2O2可促進(jìn)HeLa 細(xì)胞的增殖，抑制AQP3 的表達(dá)則抑制HeLa 細(xì)胞增殖；損傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，低濃度的H2O2可促進(jìn)HeLa 細(xì)胞的遷移，抑制AQP3 的表達(dá)則抑制HeLa 細(xì)胞遷移。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，AQP3 介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中H2O2轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)宮頸癌HeLa 細(xì)胞的遷移、增殖，抑制AQP3 的表達(dá)則減弱腫瘤微環(huán)境中H2O2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，從而抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞的遷移、增殖。目前認(rèn)為H2O2不再是細(xì)胞代謝過程中的有毒副產(chǎn)品，而是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的第二信使，主要通過氧化關(guān)鍵含硫基蛋白的敏感位點(diǎn)、調(diào)控相關(guān)信號(hào)從而參與多種生理病理過程[6-7]，而癌細(xì)胞中持續(xù)上調(diào)的H2O2依賴信號(hào)調(diào)控凋亡、增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移、能量代謝等與癌癥發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)的諸多重要過程[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道，AQP3、AQP8介導(dǎo)H2O2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)加速鼠T 細(xì)胞的遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的能量合成代謝和細(xì)胞增殖[10-11]，抑制AQP8 表達(dá)則可抑制H2O2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及下游靶蛋白的酪氨酸磷酸化[12]。但高濃度H2O2也可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞凋亡[6]。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。由于H2O2的這種雙重效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞上調(diào)抗氧化系統(tǒng)如超氧化物歧化酶等以降低細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度，形成適當(dāng)?shù)腍2O2濃度梯度從而選擇性、局灶性啟動(dòng)H2O2信號(hào)事件[13]。臨床上宮頸癌常合并長期慢性宮頸炎并伴隨組織水腫。筆者推測(cè)，在慢性宮頸炎向?qū)m頸癌的轉(zhuǎn)化過程中，缺氧、持續(xù)性炎癥等局部微環(huán)境引起組織水腫，水腫的長期存在加重缺氧，ROS 尤其H2O2不斷產(chǎn)生，局部微環(huán)境代謝異常，觸發(fā)AQPs 將H2O2不斷轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步加重缺氧，導(dǎo)致局部組織修復(fù)信號(hào)過多，誘使局部細(xì)胞過度增殖，甚至癌變。

文獻(xiàn)報(bào)道，PKB 信號(hào)通路參與多種惡性腫瘤包括宮頸癌的發(fā)生、進(jìn)展[14-15]。本研究Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGF 刺激10 min 后用200 μmol/L H2O2作用于HeLa 細(xì)胞20 min，激發(fā)PKB 磷酸化，抑制AQP3 的表達(dá)則減弱PKB 磷酸化。本研究結(jié)果提示AQP3 能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)腫瘤微環(huán)境中的H2O2，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)依賴第二信使H2O2的下游信號(hào)PKB，從而促進(jìn)HeLa 細(xì)胞的增殖、遷移。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，AQP3 介導(dǎo)H2O2吸收激活人結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)PKB，與筆者的結(jié)果相似。

綜上所述，AQP3 介導(dǎo)宮頸癌HeLa 細(xì)胞中H2O2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)依賴第二信使H2O2的下游信號(hào)PKB，促進(jìn)宮頸癌HeLa 細(xì)胞的增殖、遷移。本研究結(jié)果尚需在更多的腫瘤細(xì)胞系和癌組織中得到證實(shí)。