李燦宇，劉歡歡，黨秋紅，申愛榮，封全靈

（鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 1.婦科，2.病理科，河南 鄭州 450052）

子宮腺肌病是嚴(yán)重危害婦女健康的一種疾病，發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]，血管生成可能是子宮腺肌病發(fā)生的重要因素[2]。半乳糖凝集素3（Galectin-3）與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，是潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[3]。Galectin-3 在調(diào)節(jié)血管生成中也發(fā)揮重要作用[4]，但其在子宮腺肌病發(fā)生中的作用尚不清楚。本研究檢測Galectin-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在子宮腺肌病在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)，分析3 者在異位內(nèi)膜組織中高表達(dá)的相關(guān)性，以期為探討子宮腺肌病新的治療策略提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2015年12月鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的子宮腺肌病患者40例作為子宮腺肌病組，年齡34～54 歲，分別取其在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織用于研究，其中分泌期內(nèi)膜25 例，增殖期內(nèi)膜15 例。選取同期子宮肌瘤患者40例作為正常對(duì)照組，排除子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜異位癥患者，取其正常子宮內(nèi)膜組織用于研究，其中分泌期內(nèi)膜22 例，增殖期內(nèi)膜18 例。從上述患者中分別選取20 例子宮腺肌病在位內(nèi)膜和正常對(duì)照子宮內(nèi)膜組織用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）和Western blotting 檢測，新鮮組織標(biāo)本采集后液氮冷凍保存，所用組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定后石蠟包埋保存。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，所有標(biāo)本采集征得患者同意并簽署知情同意書。

1.2 序列與試劑

Galectin-3 引物序列參考文獻(xiàn)[5]，其他引物同參考文獻(xiàn)[6]（Galectin-3，正向引物：5'-GAATGATGTTGCCT TCCAG-3'，反向引物：5'-CACTGGTGAGGTCTATGTCA C-3'；MMP-9，正向引物：5'-TTGACAGCGACAAGAAG TGG-3'，反向引物：5'-TCAGGGCGAGGACCATAGA-3'；VEGF，正向引物：5'-CCCACCCACATACATACAT T-3'，反向引物：5'-CTCCCAACTCAAGTCCACA-3'）。Trizol 試劑、Taq Master Mix（CW0682M）、兔抗人GAPDH 多克隆抗體（CW0101M）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，羊抗人MMP-9 多克隆抗體（SC-6840）、鼠抗人Galectin-3 單克隆抗體（TA804697）、鼠抗人VEGF 單克隆抗體（TA803263）、兔抗人單克隆抗體MMP-9（ZA-0562）和兔抗人多克隆抗體VEGF（ZA-0509）購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3 RT-PCR 檢測

Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)分析純度，A260/A280 為1.8～2.0。選 擇GAPDH為內(nèi)參，在MMLV RTase 作用下以隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系共50 μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性90 s，94℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸1 min，重復(fù)30 個(gè)循環(huán)后72℃再延伸5 min，最后4℃終止反應(yīng)。RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳。以目的基因與內(nèi)參的平均吸光度比值來計(jì)算目的基因mRNA 的表達(dá)水平。

1.4 Western blotting 檢測

取組織各0.2 g 于液氮中砸碎，研磨成粉末狀后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，置于冰上20 min，經(jīng)超聲處理后于4℃、12 000 r/min 離心30 min，收集上清液并用Bradford 法定量。用10% SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%脫脂牛奶封閉后用TBST 緩沖液洗凈，分別加入一抗4℃過夜。之后回收一抗，TBST 洗凈后加入辣根過氧化物酶（HRP）二抗，1 h 后洗膜，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）底物顯影。以Image-Pro Plus 6.0 掃描計(jì)算吸光度值，以目標(biāo)蛋白與GAPDH 蛋白的比值來表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測

所有組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，3 μm 連續(xù)切片，用蘇木精-伊紅（haematoxylin endeosin,HE）染色法觀察病理變化，用Envision 免疫組織化學(xué)二步法檢測蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，陽性對(duì)照切片由試劑公司提供，染色結(jié)果為陽性。陰性對(duì)照用PBS 緩沖液代替一抗，染色結(jié)果為陰性。

1.6 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

每張切片選10 個(gè)高倍視野（400 倍），根據(jù)染色范圍及染色強(qiáng)度來計(jì)算評(píng)分。按陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：無陽性細(xì)胞者為0 分，1%～25%為1 分，26%～50% 為2 分，51%～75% 為3 分，76%～100%為4 分；按染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：其中棕褐色為3 分，棕黃色為2 分，淡黃色為1 分，無著色為0 分。將陽性細(xì)胞所占百分比與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，所得乘積為總分。若總評(píng)分≤6 分者為低表達(dá)，總評(píng)分＞6 分 者為高表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，進(jìn)一步的兩兩比較采用χ2分割法，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2分割法兩兩比較時(shí)，P＜0.0167 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相對(duì)表達(dá)

分別檢測20 例正常對(duì)照子宮內(nèi)膜組織和20 例子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相對(duì)表達(dá)（見表1 和圖1），子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的表達(dá)與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的表達(dá)均升高。

2.2 子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相對(duì)表達(dá)

分別檢測20 例正常對(duì)照子宮內(nèi)膜組織和20 例子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相對(duì)表達(dá)（見圖1 和表2），子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白表達(dá)均升高。

表1 子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相對(duì)表達(dá) （n=20，±s）

表1 子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相對(duì)表達(dá) （n=20，±s）

組別 Galectin-3 MMP-9 VEGF正常對(duì)照組 0.350±0.091 0.281±0.089 0.288±0.086子宮腺肌病組 0.506±0.120 0.415±0.144 0.403±0.093 t 值 4.601 3.549 4.055 P 值 0.000 0.001 0.000

2.3 子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的高表達(dá)

分別檢測40 例正常對(duì)照子宮內(nèi)膜組織和40 例子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9和VEGF 蛋白表達(dá)（見圖2）。與正常對(duì)照子宮內(nèi)膜組織比較，子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中Galetin-3 和VEGF 蛋白高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3組MMP-9 蛋白高表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表3）。

2.4 子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白高表達(dá)的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Galetin-3 和MMP-9 高表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.493，P=0.001），Galetin-3 和VEGF 高表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.616，P=0.000），MMP-9和VEGF 高表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.441，P=0.004）。

圖1 Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 和蛋白的 相對(duì)表達(dá)情況

表2 子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相對(duì)表達(dá) （n=20，±s）

表2 子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相對(duì)表達(dá) （n=20，±s）

組別 Galectin-3 MMP-9 VEGF正常對(duì)照組 0.376±0.121 0.347±0.112 0.359±0.113子宮腺肌病組 0.522±0.151 0.435±0.151 0.476±0.127 t 值 3.381-2.076 3.058 P 值 0.002 0.045 0.004

圖2 正常對(duì)照子宮內(nèi)膜、子宮腺肌病在位和異位內(nèi)膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的表達(dá)（Envision 二步法 ×100）

表3 Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白在子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常對(duì)照內(nèi)膜組織中表達(dá)情況[n=40，例（%）]

3 討論

子宮腺肌病是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細(xì)胞在子宮肌層呈彌漫或局限性生長，引起月經(jīng)過多、痛經(jīng)、不孕不育等表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者身心健康，但仍缺乏有效的臨床治療策略[7]。子宮腺肌病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，可能具有較為獨(dú)特的分子病理學(xué)特征[8]，炎癥因子、增殖-凋亡失衡、血管生成等可能參與子宮腺肌病的發(fā)生[9]，因此，了解其發(fā)病機(jī)制對(duì)尋找有效治療策略有重要意義。

Galectin-3 是半乳糖凝集素家族中唯一的嵌合型成員，在人體組織中廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程，以及參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)行為[10-11]。Galectin-3 表達(dá)與子宮內(nèi)膜性疾病如子宮內(nèi)膜異位癥[12]、子宮內(nèi)膜癌[13]發(fā)生密切相關(guān)。有研究表明Galectin-3 在血管生成中也發(fā)揮重要作用，可調(diào)節(jié)腫瘤[4]、角膜等[14]多種組織新生血管生成。本研究結(jié)果顯示，Galectin-3 在子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中mRNA 和蛋白表達(dá)均高于正常對(duì)照子宮內(nèi)膜組織，而異位內(nèi)膜組織中Galectin-3 高表達(dá)率更高，提示Galectin-3 可能參與子宮腺肌病的發(fā)生，尤其是內(nèi)膜異位的發(fā)生。

VEGF 作為最強(qiáng)的血管生成因子，其高水平表達(dá)與子宮腺肌病發(fā)生關(guān)系密切，其高表達(dá)的致病機(jī)制尚不清楚[15]，雌激素可通過誘導(dǎo)VEGF 高表達(dá)及血管生成促進(jìn)子宮腺肌病的發(fā)生[16]。MMP-9 是一種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，其高表達(dá)與子宮腺肌病的發(fā)生密切相關(guān)[17]，多種信號(hào)通路可通過調(diào)節(jié)MMP-9 參與子宮腺肌病的發(fā)生[18]。MMP-9 和VEGF 還在內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡中發(fā)揮重要作用，是子宮腺肌病發(fā)生過程中的關(guān)鍵因子[16]，下調(diào)MMP-9 的表達(dá)降低腺體細(xì)胞的侵襲能力[19]。本研究結(jié)果顯示，MMP-9 和VEGF 在子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中mRNA 和蛋白表達(dá)均高于正常對(duì)照子宮內(nèi)膜組織，兩者均在異位內(nèi)膜組織中高表達(dá)且呈正相關(guān)，進(jìn)一步說明兩者可能共同參與子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展，可能有助于腺體細(xì)胞的異位侵襲。

研究表明，Galectin-3 在促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成中發(fā)揮重要作用，Galectin-3 基因敲除可通過減少VEGF 的分泌從而使腫瘤細(xì)胞血管生成障礙[20]。Galectin-3 也是MMP-9 重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)MMP-9 的表達(dá)、中斷細(xì)胞間接觸促進(jìn)上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，如發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果中Galectin-3 和VEGF、MMP-9 在異位內(nèi)膜中的高表達(dá)均呈正相關(guān)，提示3 者可能在子宮腺肌癥發(fā)生、發(fā)展尤其是異位侵襲中共同發(fā)揮作用，其具體分子調(diào)節(jié)機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，Galectin-3、VEGF 和MMP-9 在子宮腺肌病內(nèi)膜組織中表達(dá)升高，3 者在異位內(nèi)膜組織中均呈高表達(dá)且呈正相關(guān)，提示3 者高表達(dá)可能共同參與子宮腺肌病的發(fā)生和異位侵襲，為繼續(xù)探討子宮腺肌病的發(fā)生機(jī)制和新的治療策略提供參考。