乳頭狀甲狀腺癌中microRNA-599、BRD4表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

賴明華，楊嵐淞

（云南省第一人民醫(yī)院 1.乳腺甲狀腺外科，2.消毒供應(yīng)中心，云南 昆明 650032）

乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是甲狀腺癌最常見的分化類型，約占甲狀腺癌發(fā)生的85%，具有腫瘤生長緩慢、惡化程度低、潛伏時間長等特點[1]。近年來，PTC 發(fā)病率呈上升趨勢，雖然在其治療方面取得了進(jìn)展，但其存活率仍存在進(jìn)一步改善的可能。明確高危病變臨床有用預(yù)測因子是診斷和治療惰性和侵襲性疾病的關(guān)鍵[2]。MicroRNA（miRNA）是具有調(diào)節(jié)功能和顯著組織特異性的小RNA 分子，能夠調(diào)節(jié)若干通路的多個靶標(biāo)，常在癌癥中異常表達(dá)，已成為一類癌癥診斷、治療及預(yù)后判斷的新型生物標(biāo)志物[3]。大量研究表明，多個miRNAs 如miR-34a、miR-146b、miR-31、miR-221、miR-21 等 在PTC 中過量表達(dá)，與PTC 發(fā)生及預(yù)后有關(guān)[4]。但miR-599 在PTC 中表達(dá)水平及與PTC 關(guān)系鮮有報道。溴結(jié)構(gòu)域蛋 白4（bromodomain-containing protein 4,BRD4）是BET 家族主要成員之一，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究報道，抑制BRD4 表達(dá)可以影響腫瘤細(xì)胞生物活性，減緩腫瘤生長[5]。因此，本研究旨在分析miR-599 和BRD4 在PTC 癌變組織中的相對表達(dá)量及其與PTC 發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，以期為診斷和治療PTC，改善患者預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2005年5月—2007年3月云南省第一人民醫(yī)院接受甲狀腺手術(shù)的PTC 患者52 例作為研究對象。其中，男性14 例，女38 例；年齡27～45 歲，平均（35.13±7.02）歲；癌旁正常甲狀腺組織41 例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會癌癥分期手冊中分化型甲狀腺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[6]：Ⅰ期24 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期8 例，Ⅳ期5 例。每例患者切除甲狀腺后，立即留取腫瘤組織和癌旁正常甲狀腺組織（距腫瘤1 cm 處正常甲狀腺組織），置于液氮中冷凍保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者符合甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診療指南中PTC 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②病灶＞5 mm；③均行全甲狀腺切除手術(shù)；④經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及其家屬知情并自愿簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他分化型甲狀腺癌，如濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌；②有其他臟器腫瘤；③術(shù)前因其他腫瘤進(jìn)行過放化療治療；④有既往頸部手術(shù)史。

1.2 試劑與序列

RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司，BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，BRD4 抗體和GAPDH 抗體購自美國Cell Signaling 公司，ECL 超敏發(fā)光液和Western blotting 一抗稀釋液購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-599 正向引物：5'-GUU GUGUCAGUUUAUCAAAC-3'，反向引物：5'-CTCCTAT CGCACTTTAATCTCTAACT-3'；內(nèi)參U6 snRNA 正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；BRD4正向引物：5'-GTGGGAGGAAAGAAACAGGGACA-3'，反向引物：5'-AGGAGGAGGATTCGGCTGAGG-3'；內(nèi)參GAPDH 正向引物：5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCA G-3'，反向引物：5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTG-3'。

1.3 方法

1.3.1 RNA 和蛋白提取取液氮中保存的甲狀腺腫瘤組織和正常組織，研磨，組織總RNA 和總蛋白的提取采用試劑盒法，純化后采用分光光度儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）檢測總RNA 濃度和純度，提取RNA 溶液A260/A280 值＞1.8 可用于后續(xù)檢測，同時采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測提取純化后蛋白濃度。

1.3.2 RT-PCR提取總RNA 溶液經(jīng)稀釋后，用于逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR 檢測miR-599 相對表達(dá)量，以U6 snRNA 為內(nèi)參對照，RT-PCR 擴增總體系20 μl，Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，模板2 μl，DEPC 水6 μl。RT-PCR 程序：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min 循環(huán)擴增，共40 個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3 次。

1.3.3 Western blotting取蛋白樣品，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜后，分別加入BRD 抗體和GAPDH 抗體稀釋溶液中，4℃、低速震蕩條件下，孵育過夜。取出后用15 ml TBST 沖洗3 次，10 min/次。沖洗后，將膜放于辣根過氧化酶標(biāo)記的?？故蟮诙贵wIgG 孵育液中，震蕩孵育1 h，取出后用15 ml TBST 沖洗3 次，10 min/次。最后，將膜放入ECL 顯影液中，充分接觸3～5 min，UVP 凝膠成像儀中曝光、拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，繪制Kaplan-Meier 生存曲線，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-599、BRD4 在PTC 組織中的表達(dá)

癌變組織中miR-599 相對表達(dá)量與正常組織中miR-599相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），癌變組織低于正常組織（見表1）；癌變組織中BRD4相對表達(dá)量與正常組織中BRD4 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），癌變組織高于正常組織（見表1 和圖1）。

2.2 miR-599、BRD4 相對表達(dá)量與PTC 臨床病理特征的關(guān)系

TNM 分期晚的患者miR-599 相對表達(dá)量低于分期早的患者（P＜0.05），TNM 分期晚的患者BRD4 相對表達(dá)量高于分期早的患者（P＜0.05）；腫瘤直徑＞1 cm 患者miR-599 相對表達(dá)量低于腫瘤直徑≤1 cm 患者（P＜0.05），腫瘤直徑＞1 cm 患者BRD4 相對表達(dá)量高于腫瘤直徑≤1 cm 患者（P＜0.05）；腫瘤侵犯包膜患者miR-599 相對表達(dá)量低于腫瘤未侵犯包膜患者（P＜0.05），腫瘤侵犯包膜患者BRD4 相對表達(dá)量高于腫瘤未侵犯包膜患者（P＜0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-599 相對表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者BRD4 相對表達(dá)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）。見表2。

表1 miR-599、BRD4 在癌變組織和正常組織中的相對表達(dá)量比較 （±s）

表1 miR-599、BRD4 在癌變組織和正常組織中的相對表達(dá)量比較 （±s）

組別 nmiR-599 BRD4癌變組織 52 0.88±0.10 4.57±1.27正常組織 41 3.12±0.84 1.25±0.31 t 值 19.086 18.200 P 值 0.000 0.000

圖1 BRD4 蛋白相對表達(dá)量

2.3 miR-599、BRD4 相對表達(dá)量與預(yù)后關(guān)系

miR-599 和BRD4 相對表達(dá)量以癌變組織中平均表達(dá)量值為界，分為高水平和低水平。高水平患者miR-599 和BRD4 與低水平患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。高水平miR-599 患者5 和10年病死率均低于低水平患者；高水平BRD4 患者5 和10年病死率均高于低水平者。見表3 和圖2。

2.4 miR-599、BRD4 相對表達(dá)量相關(guān)性分析

PTC 癌變組織中miR-599 與BRD4 相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.872，P=0.000）。見圖3。

表2 PTC 臨床病理參數(shù)與miR-599、BRD4 相對表達(dá)量的關(guān)系

表3 miR-599、BRD4 相對表達(dá)量與預(yù)后關(guān)系 例（%）

圖2 miR-599、BRD4 相對表達(dá)量高水平組和低水平組生存曲線

圖3 miR-599、BRD4 相對表達(dá)量相關(guān)性分析

3 討論

PTC 是甲狀腺組織中最常見的惡性腫瘤，受激素、遺傳、環(huán)境等因素影響，在基因方面，PTC 的特征是通過激活BRAF 和RET/PTC 基因重組中的基因突變而改變RET/PTC-RAS-BRAF 信號傳導(dǎo)途徑[8]。正常細(xì)胞中基因表達(dá)受到復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的高度調(diào)控，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)被阻斷或異常過量表達(dá)則可能引發(fā)各種疾病，包括癌癥[9]。miRNA 是一類長度約為20～24 個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，一個miRNA 可以同時調(diào)控多個靶基因，多個miRNA 也可以調(diào)控同一個基因[10]。miRNAs 通過干擾蛋白表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡，通常導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制或靶基因降解和基因沉默，越來越多的研究表明，miRNAs 異常表達(dá)與癌癥發(fā)生相關(guān)，表現(xiàn)出在正常組織和腫瘤組織中表達(dá)量不同[11]。戴璇璇等[12]采用基因芯片技術(shù)和RNA 印記雜交法檢測PTC 甲狀腺組織中miRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-34a、miR-146b、miR-31、miR-221、miR-21 在PTC 甲狀腺腫瘤組織中過表達(dá)，并提示miR-221 和miR-146 在PTC 預(yù)后預(yù)測中具有重要作用。SUN 等[13]研究報道，miR-146a 和miR-146b 在甲狀腺組織中過量表達(dá)與PTC 發(fā)生及惡化有關(guān)，可能是PTC 潛在的生物標(biāo)志。PERDAS 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，let-7 miRNA 能夠抑制腫瘤RAS 基因表達(dá)，起到抑制腫瘤作用，可作為PTC 的新型診斷、治療、監(jiān)測及預(yù)后標(biāo)志物。李桂榮等[15]研究報道，miR-221 和miR-222 在PTC 癌變組織中過表達(dá)，與PTC 腫瘤侵犯包膜、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，miR-221 和miR-222 對PTC 臨床診斷、治療及預(yù)后有指導(dǎo)意義。

目前，miR-599 已被發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌和乳腺癌中表達(dá)下調(diào)。TIAN 等[16]研究報道，hsa-miR-599 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下降，而hsa-miR-599 過表達(dá)可通過抑制靶基因MYC 抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示hsa-miR-599 可以作為肝細(xì)胞癌診斷和治療的生物標(biāo)志物。但miR-599 在PTC 中表達(dá)尚未見報道。本研究采用RT-PCR 檢測PTC 甲狀腺癌變組織和癌旁正常組織中miR-599 的相對表達(dá)量，miR-599 在PTC癌變組織中相對表達(dá)量低于正常組織。miR-599 相對表達(dá)量與患者病理特征關(guān)系分析結(jié)果表明，miR-599相對表達(dá)量在PTC 患者TNM 分期、腫瘤直徑、腫瘤有無侵犯包膜、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移方面存在差異，與在肝細(xì)胞癌和乳腺癌中表達(dá)趨勢相同，說明miR-599 相對表達(dá)量與PTC 發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。miR-599 相對表達(dá)量高水平患者5 和10年病死率均顯著低于miR-599 相對表達(dá)量低水平患者，說明miR-599 相對表達(dá)量影響患者預(yù)后。

BRD4 是BET 家族成員，可以通過結(jié)合乙?；M蛋白而影響下游基因轉(zhuǎn)錄，加快腫瘤細(xì)胞生長，許多研究已證實，BRD4 抑制劑可以導(dǎo)致癌細(xì)胞周期停滯或凋亡，是癌癥治療的新靶點[17-18]。有研究報道，BRD4 在膀胱癌病變組織中過量表達(dá)，通過上調(diào)C-myc 正向調(diào)節(jié)EZH2，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，而抑制BRD4 能夠減少癌細(xì)胞增殖，同時促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，提示BRD4 是一種干擾轉(zhuǎn)錄程序治療癌癥的新型藥理治療靶點。在小細(xì)胞肺癌中BRD4 有同樣的表達(dá)趨勢[19]。在甲狀腺癌中，GAO 等[20]研究報道，BRD4 在甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)，而抑制BRD4 表達(dá)可導(dǎo)致癌細(xì)胞周期停滯，增強患者碘攝取進(jìn)而抑制腫瘤生長。本研究結(jié)果，BRD4 在PTC 癌變組織中相對表達(dá)量高于正常組織，BRD4 相對表達(dá)量在PTC 患者TNM 分期、腫瘤直徑、腫瘤有無侵犯包膜、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有差異，且BRD4相對表達(dá)量高水平患者5 和10年病死率高于BRD4 相對表達(dá)量低水平患者，與GAO 等研究趨勢一樣，說明BRD4 與PTC 發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。WANG 等[21]研究報道，hsa-miR-599 在乳腺癌中通過下調(diào)BRD4 抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、生長。本研究對PTC 癌變組織中miR-599 和BRD4 相對表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果，PTC癌變組織中miR-599 和BRD4 相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，說明miR-599 和BRD4 在PTC 中也可能存在相互作用關(guān)系。

綜上所述，miR-599 在PTC 癌變組織中下調(diào)，BRD4 在PTC 癌變組織中上調(diào)，可能參與PTC 患者癌細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移，影響患者預(yù)后，可作為臨床診斷、治療PTC，預(yù)測患者預(yù)后的靶基因。本研究初步分析miR-599 和BRD4 在PTC 癌變組織中的相對表達(dá)趨勢，而對其作用機制尚不完全清楚，因此需進(jìn)一步研究miR-599 和BRD4 影響PTC 患者臨床病理特征及對PTC 癌細(xì)胞生物活性的作用機制。