李美嬌?鄧慧儀?王瑋豪?孔維封?袁田?邱惠軍?解子驍?黃雪琨?楊欽泰

【摘要】 目的 研究Ki-67和Yes相關(guān)蛋白（YAP）在鼻息肉組織中的表達(dá)，探討維替泊芬對(duì)人鼻息肉上皮細(xì)胞（hNPEC）增殖的影響。方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法分別檢測(cè)正常下鼻甲黏膜組織和鼻息肉組織的Ki-67和YAP的mRNA及蛋白水平。體外培養(yǎng)hNPEC，噻唑藍(lán)比色法（MTT）確定維替泊芬的半數(shù)抑制濃度（IC50），蛋白免疫印跡法檢測(cè)維替泊芬IC50處理組中Ki-67、YAP及TEAD1的蛋白表達(dá)，免疫熒光染色觀察Ki-67、YAP的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。結(jié)果 在鼻息肉組織中， Ki-67和YAP的mRNA和蛋白表達(dá)均高于下鼻甲對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）。維替泊芬作用hNPEC 24 h后IC50為2.516 μmol/L。維替泊芬下調(diào)hNPEC中Ki-67及YAP、TEAD1的蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）。免疫熒光染色顯示維替泊芬組中Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)較少，YAP核內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯降低。 結(jié)論 維替泊芬可能通過抑制YAP-TEAD復(fù)合物來抑制hNPEC的增殖。

【關(guān)鍵詞】 鼻息肉;細(xì)胞增殖;維替泊芬;Yes相關(guān)蛋白;Ki-67

慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP） 是慢性鼻竇炎的一種類型，其病理學(xué)特征是黏膜慢性炎癥和上皮異常的組織重塑，目前已知上皮結(jié)構(gòu)和功能異常包括增生和鱗狀化生，常因?qū)ζ湔J(rèn)識(shí)不足或治療不恰當(dāng)?shù)仍蛟斐煽刂撇患裑1-2]。鼻息肉是一種多因素炎癥性疾病，涉及多種細(xì)胞信號(hào)途徑和多種內(nèi)型[3]。

Hippo-Yes相關(guān)蛋白（YAP）信號(hào)通路已被證實(shí)在細(xì)胞增殖、凋亡和分化的調(diào)節(jié)中起重要作用，并且可以調(diào)節(jié)發(fā)育、器官大小、組織穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)生[4]。YAP為Hippo通路的主要效應(yīng)分子，是發(fā)育和生理再生過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，但如果失控，則可以誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌癥進(jìn)展[5]。在肺發(fā)育過程中，Hippo通路及其核心效應(yīng)物YAP在氣道上皮細(xì)胞增殖和分化中起關(guān)鍵作用，提示在鼻息肉上皮中細(xì)胞增殖也可能與YAP密切相關(guān)[6]。

維替泊芬是一種光敏劑，研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬作為非光敏劑會(huì)抑制YAP基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，能夠在沒有光激活的情況下破壞YAP-TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（TEAD）相互作用，而且維替泊芬會(huì)誘導(dǎo)增殖標(biāo)志物如Ki-67、c-Myc或參與細(xì)胞周期進(jìn)程的不同細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的丟失，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[7-8]。但目前尚未見維替泊芬作用于人鼻息肉上皮細(xì)胞（hNPEC）的報(bào)道。本研究旨在探討YAP和Ki-67在正常鼻黏膜組織和鼻息肉組織中的表達(dá)差異，并初步探討維替泊芬對(duì)hNPEC增殖的影響，以期為鼻息肉的治療提供新的思路。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

鼻息肉標(biāo)本20例納入鼻息肉組，來自2017年6月至2018年6月期間在我院住院手術(shù)治療的CRSwNP患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照歐洲EPOS[1]。同期住院行鼻中隔偏曲矯正術(shù)，因術(shù)中暴露解剖結(jié)構(gòu)的需要而切除的正常下鼻甲的10例患者納入下鼻甲對(duì)照組（表1）。所有患者均需停用全身或口服糖皮質(zhì)激素至少1個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在免疫缺陷、凝血功能異常、真菌性鼻竇炎或懷孕的患者。所有患者均已簽署知情同意書，并且已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

二、RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

采用Trizol試劑提取鼻黏膜組織和hNPEC的總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒將每個(gè)樣品的總RNA（1 μg）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過ABI 7500 FAST儀器進(jìn)行基因表達(dá)分析，檢測(cè)YAP、TEAD、和Ki-67的mRNA水平。使用7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增，采用兩步法（在95 ℃下預(yù)變性30 s，然后在95 ℃下45次擴(kuò)增5 s，60 ℃下擴(kuò)增34 s）進(jìn)行熔解曲線分析，以評(píng)價(jià)引物的特異性。引物序列見表2。用2-ΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

三、蛋白免疫印跡法檢測(cè)

將鼻息肉及下鼻甲組織放入研缽研磨成粉末后，加入適量的裂解液，使用玻璃勻漿器研磨充分后4℃，12 000 g離心5 min，收集上清。按照BCA試劑盒操作說明檢測(cè)提取的蛋白濃度。充分混勻蛋白樣品與上樣緩沖液，沸水變性5 min。原代hNPEC用PBS液沖洗3次，用蛋白裂解液（RIPA）在冰上裂解細(xì)胞收集總蛋白，將15 μl蛋白在8% SDS-PAGE凝膠中電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。 轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜在5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，在單克隆抗體稀釋液（YAP為1∶1 000，Ki-67為1∶600，GAPDH為1∶3 000） 中4 ℃孵育過夜后，在濃度為1∶3 000的二抗中室溫孵育1 h， TBST清洗后在化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光劑中顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。用Qunatity One軟件處理分析條帶光密度值，以目的蛋白/內(nèi)參的比值來表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

四、hNPEC體外分離和原代培養(yǎng)

新鮮的鼻息肉組織新鮮標(biāo)本，用含補(bǔ)充青霉素、鏈霉素和兩性霉素的PBS反復(fù)沖洗，以清除分泌物和骨頭，加入2倍于組織體積的DispaseⅡ 酶，4 ℃消化過夜。次日組織懸液用含有0.25% EDTA的胰酶孵育消化15 min，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基研磨3次，制成單細(xì)胞懸液，在無血清支氣管上皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基（BEGM）中培養(yǎng)7 ～ 10 d，細(xì)胞密度達(dá)到85% ～ 90%時(shí)按實(shí)驗(yàn)要求處理細(xì)胞。

五、噻唑藍(lán)比色法（MTT）試驗(yàn)

hNPEC接種于96孔板，每孔100 μl，細(xì)胞數(shù)104個(gè)/孔，37 ℃培養(yǎng)4 ～ 5 d至細(xì)胞貼壁。分3組：對(duì)照組不加維替泊芬，不同濃度維替泊芬（0、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L）組，每個(gè)劑量組合設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞經(jīng)維替泊芬處理后，在暗室37 ℃環(huán)境下分別溫育12、24、48 h，加入5 mg/ml MTT，每孔10 μl，37 ℃溫育4 h，每孔加入三聯(lián)液（SDS 10 g，異丁醇5 ml，10 M HCl 0.1 ml）150 μl，振蕩10 min之后37℃過夜，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的吸光度（OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

六、細(xì)胞免疫熒光

將hNPEC鋪板至24孔板內(nèi)多聚賴氨酸處理的細(xì)胞爬片上，調(diào)整細(xì)胞數(shù)104個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后取出使用PBS清洗3次， 4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗后加入一抗（YAP濃度為1∶100，Ki-67濃度為1∶800）4 ℃孵育過夜，PBS沖洗后加入熒光二抗（1∶400）37 ℃孵育1 h，PBS沖洗后加入DAPI常溫孵育5 min，封固后熒光顯微鏡下觀察拍照。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行分析。正態(tài)分布連續(xù)性定量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);非正態(tài)分布定量資料用中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示，組間比較用秩和檢驗(yàn)。定性資料組間比較采用Fisher確切概率法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad 7.0軟件繪圖。

結(jié) 果

一、Ki-67及YAP在下鼻甲和鼻息肉中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，下鼻甲（n=10）和鼻息肉（n=20）中均可檢測(cè)到Ki-67和 YAP的mRNA表達(dá)，而鼻息肉組Ki-67和YAP的 mRNA表達(dá)均高于下鼻甲對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z= -2.684， P=0.006; Z=-2.090， P=0.035， 圖1）。

同時(shí)，蛋白免疫印跡法結(jié)果也顯示，下鼻甲（n=4）和鼻息肉（n=6）中均可檢測(cè)到Ki-67和YAP蛋白表達(dá)，并且鼻息肉中Ki-67和YAP蛋白的表達(dá)均高于下鼻甲對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.767， P=0.028;t=-2.454， P=0.040， 圖2）。

二、維替泊芬對(duì)hNPEC增殖的影響

采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)維替泊芬是否影響hNPEC的增殖水平。用不同濃度的維替泊芬（0、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L）處理hNPEC，分別處理12、24、48 h后予MTT檢測(cè)。結(jié)果表明，維替泊芬以濃度和時(shí)間依賴的方式抑制細(xì)胞增殖活力（n=3， 圖3A）。根據(jù)MTT測(cè)定結(jié)果，維替泊芬處理hNPEC 24 h時(shí)的IC50值為2.516±0.246 μmol/L （n=3， 圖3B），后續(xù)實(shí)驗(yàn)將直接采用維替泊芬的IC50。

三、維替泊芬對(duì)hNPEC YAP表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，分別用0、2.516 μmol/L維替泊芬處理hNPEC 24 h后，YAP （t=4.536， P=0.011）及其轉(zhuǎn)錄因子TEAD1（t=9.732， P=0.001），Ki-67（t=4.114， P=0.015）的表達(dá)水平降低（n=3， 圖4）。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，鼻息肉組織中YAP分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其中主要在核內(nèi)分布;2.516 μmol/L維替泊芬處理hNPEC后，Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)減少，而YAP在hNPEC中的定位無明顯變化，但核內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯降低（圖5）。

討 論

Hippo信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高度保守，作為Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的下游重要轉(zhuǎn)錄激活因子，YAP是Hippo通路中的關(guān)鍵蛋白，已被證實(shí)調(diào)控多種基因的表達(dá)，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、器官發(fā)育和修復(fù)等作用[9]。

已有文獻(xiàn)證明鼻息肉組織中的上皮細(xì)胞增殖率高于正常鼻黏膜[10]。Ki-67核抗體作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的預(yù)后標(biāo)志物已廣泛使用數(shù)十年，鼻息肉重塑的上皮中Ki-67陽性細(xì)胞增多[11]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常下鼻甲黏膜組織相比，YAP在鼻息肉組織中的表達(dá)顯著增加，同時(shí)增殖標(biāo)志物Ki-67表達(dá)上調(diào)，提示YAP可能具有促進(jìn)hNPEC增殖的作用[12]。

作為一種光敏劑，維替泊芬以往被廣泛且安全地用于新生血管性黃斑變性以及多種人類腫瘤[13]。近些年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬作為非光敏激活劑時(shí)也有至關(guān)重要的治療作用[14]。本研究的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，維替泊芬根據(jù)濃度和時(shí)間依賴性的方式抑制hNPEC的增殖，并且進(jìn)一步通過蛋白免疫印跡法和免疫熒光檢測(cè)Ki-67證實(shí)，提示維替泊芬可抑制hNPEC的增殖。

已報(bào)道YAP可與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，包括對(duì)細(xì)胞發(fā)育和癌癥進(jìn)展至關(guān)重要的TEAD[5]。一些研究表明YAP作為Hippo通路的核心效應(yīng)蛋白，通過與TEAD蛋白的相互作用，可以觸發(fā)靶基因如Areg的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。此外，gp130信號(hào)通過激活YAP促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致抵抗黏膜浸潤[15]。而維替泊芬可能通過破壞YAP-TEAD復(fù)合物和預(yù)防YAP誘導(dǎo)的致癌性生長，從而對(duì)多種腫瘤生長具有直接抑制作用，這一過程，可以是通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬或凋亡，又或者是影響細(xì)胞分化[8，16-21]。在我們的研究中，維替泊芬處理后的hNPEC中YAP、TEAD1和Ki-67的表達(dá)明顯降低，結(jié)果提示維替泊芬對(duì)鼻息肉的抑制作用有可能是通過下調(diào)YAP、TEAD，從而抑制Ki-67的表達(dá)。

綜上所述，維替泊芬在體外可以抑制hNPEC的生長和增殖，并且這種細(xì)胞生長的抑制可能與YAP-TEAD復(fù)合體的干擾相關(guān)。YAP可能參與鼻息肉的發(fā)病過程，是治療鼻息肉的潛在靶點(diǎn)。根據(jù)本研究結(jié)果可推測(cè)維替泊芬可以作為鼻息肉的潛在治療方法。但其具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的深入研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2018-10-16）

（本文編輯：楊江瑜）