宋亮,張劍南,劉海坤,莫春橫,李娟,王亞軍
(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都610065)
G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是細(xì)胞表面蛋白的一個(gè)大家族,由于其結(jié)構(gòu)、配體和表達(dá)組織的多樣性,是多細(xì)胞生物協(xié)調(diào)進(jìn)化的主要參與者(Hellebrandetal.,2000)。GPCRs具有典型7次跨膜結(jié)構(gòu)域(Straderetal.,1995;Gether & Kobilka,1998)。細(xì)胞外刺激如神經(jīng)遞質(zhì)、激素或光可激活GPCRs,誘導(dǎo)GTP結(jié)合蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Matsumotoetal.,2000)。許多GPCRs的配體尚不清楚,這些受體被稱(chēng)為孤兒受體(Hellebrandetal.,2000)。GPCRs常作為藥物的靶點(diǎn)(Wilsonetal.,1998;Wiseetal.,2002;Vassilatisetal.,2003),在所有使用的藥物中,50%~60%依賴(lài)GPCR發(fā)揮其效應(yīng)(Gudermannetal.,1995)。
GPR85是2000年報(bào)道的一個(gè)新GPCR亞家族中的一員,該亞家族被稱(chēng)為腦部表達(dá)的超保守受體(super conserved receptor expressed in brain,SREB)家族(Matsumotoetal.,2000)。據(jù)統(tǒng)計(jì),GPR85基因變異與精神分裂癥疾病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)(Radulescuetal.,2013)。過(guò)度表達(dá)GPR85的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出與某些精神分裂癥模型相符合的行為(Matsumotoetal.,2008)。GPR85基因敲除小鼠腦質(zhì)量顯著增加,并有記憶力增強(qiáng)的趨勢(shì),表明GPR85是腦質(zhì)量的決定因素(Matsumotoetal.,2008)。也有研究表明,GPR85是成人神經(jīng)發(fā)生和相應(yīng)認(rèn)知功能的負(fù)調(diào)控因子,可能與精神分裂癥以外的神經(jīng)精神狀況有關(guān)(Chenetal.,2012)。GPR85還可能與突觸后密度蛋白(PSD-95)-神經(jīng)配蛋白復(fù)合物相互關(guān)聯(lián),對(duì)孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)產(chǎn)生影響(Fujitajimboetal.,2015)。
SREB家族受體是通過(guò)多巴胺D4受體序列相似性搜索被發(fā)現(xiàn)的(Matsumotoetal.,2000,2005),由SREB1(GPR27)、SREB2(GPR85)、SREB3(GPR173)3個(gè)成員組成(Matsumotoetal.,2000),三者之間有高度的氨基酸序列一致性(52%~63%),但與其他GPCR亞家族的一致性卻低于25%(Matsumotoetal.,2005)。GPR85迄今仍是一個(gè)孤兒受體,它在哺乳動(dòng)物中高度保守,在人Homosapiens、小鼠Musmusculus和大鼠Rattusnorvegicus序列中100%相同(Hellebrandetal.,2000;Jeonetal.,2002)。哺乳類(lèi)GPR85與斑馬魚(yú)Daniorerio的也有94%的氨基酸序列一致性(Matsumotoetal.,2000)。這種相似度比其他GPCR更高(Yamaguchi & Brenner,1997;De Lucchinietal.,2001;Loganetal.,2003)。SREB1與SREB3在哺乳類(lèi)中也高度保守,在人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物中分別具有97%和99%的序列一致性(Matsumotoetal.,2005)。雖然SREB家族序列在脊椎動(dòng)物中高度保守,但其同源基因在線(xiàn)蟲(chóng)或黑腹果蠅Drosophilamelanogaster基因組序列中卻未發(fā)現(xiàn),這表明SREB家族可能起源于脊椎動(dòng)物的祖先(Matsumotoetal.,2000,2005)。
鑒于GPR85在非哺乳類(lèi)脊椎動(dòng)物類(lèi)群尤其是鳥(niǎo)類(lèi)中的研究尚屬空白,因此,本研究以家雞Gallusgallusdomesticus為模型動(dòng)物,克隆家雞GPR85基因的全長(zhǎng)cDNA序列,并揭示其結(jié)構(gòu),同時(shí)對(duì)GPR85基因在家雞各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行探究。以揭示GPR85在鳥(niǎo)類(lèi)與哺乳類(lèi)中的功能異同,尋找家雞GPR85的內(nèi)源性配體以及探究其在家雞組織中的生理作用奠定基礎(chǔ),也為GPR85在哺乳類(lèi)中的研究提供參考。
購(gòu)自四川牧星養(yǎng)雞場(chǎng)的羅曼粉性成熟的公雞、母雞各3只;購(gòu)自美國(guó)Molecular Research Center公司的RNA提取所用的RNAzol;購(gòu)自日本TOYOBO公司的高保真KOD-FX DNA聚合酶、10×A-attachment Mix、pTA2載體;購(gòu)自TaKaRa公司的限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Easy-Taq DNA聚合酶、dNTPs、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶等;購(gòu)自Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit;本實(shí)驗(yàn)室制備保存大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞;購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司的DNA 純化膠回收試劑盒;由成都擎科公司完成引物合成、DNA測(cè)序;購(gòu)自Bio-Rad公司的PCR儀(S1000 Thermal Cycler)、熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96)、熒光染料EvaGreen、96孔熒光定量PCR板、塑料封膜等。
1.2.1 組織RNA提取取家雞全腦、端腦、中腦、小腦、后腦、下丘腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、皮膚、肌肉、脂肪、胰腺、十二指腸、腎上腺、卵巢、精巢等組織于液氮中充分研磨,取約60 mg組織于1.5 mL EP管中,立即加入600 μL的RNAzol用勻漿器勻漿,冰上放置10 min后,加入240 μL的DEPC-H2O,劇烈渦旋15 s,放置15 min,12 000 r·min-1離心10 min,取700 μL上清液,加入3.5 μL的4-溴苯甲醚,劇烈渦旋15 s,放置5 min,12 000 r·min-1離心10 min,小心快速取600 μL上清液,加入等體積異丙醇,顛倒混勻,放置20 min,12 000 r·min-1離心10 min,棄上清,加入600 μL 75%乙醇(DEPC-H2O配制)洗滌沉淀,4 000 r·min-1離心3 min,棄上清,室溫放置晾干,加入30 μL DEPC-H2O使RNA充分溶解。
1.2.2 cDNA模板制備以家雞各組織總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA模板。取各組織總RNA 2 μg,Oligo-dT 1 μL,DEPC-H2O補(bǔ)足至5 μL,70 ℃加熱10 min,取出后冰浴2 min,然后加入5×緩沖液2 μL,dNTPs 0.5 μL,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U·μL-1) 0.5 μL,DEPC-H2O 2 μL,放入PCR儀中42 ℃孵育1.5 h,70 ℃加熱10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用DEPC-H2O稀釋至60 μL作為cDNA模板。
1.2.3 引物設(shè)計(jì)依據(jù)NCBI預(yù)測(cè)的家雞GPR85基因mRNA序列(GenBank登錄號(hào):XM_004937542)和已知的β-actin基因mRNA序列,設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增cDNA序列或檢測(cè)其組織表達(dá)。利用克隆得到的GPR85基因編碼區(qū)序列,設(shè)計(jì)家雞GPR85基因5’和3’-RACE引物(表1)。
表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primers used in the study
注: 下劃線(xiàn)表示引物設(shè)計(jì)時(shí)添加的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)
Note: Restriction sites added at the 5’-end of the primers are underlined
1.2.4 家雞GPR85基因編碼區(qū)的克隆以家雞全腦cDNA為模板,按照KOD FX高保真DNA聚合酶(TOYOBO)的說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系,PCR條件為:94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,68 ℃延伸90 s,36個(gè)循環(huán);最后68 ℃延伸20 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,利用DNA純化試劑盒回收產(chǎn)物,之后用限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后連接到pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen)后克隆測(cè)序。
1.2.5 家雞GPR85基因5’-RACE和3’-RACE按照SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)說(shuō)明書(shū)構(gòu)建家雞全腦組織5’或3’-RACE模板,之后利用基因特異性引物PCR擴(kuò)增GPR85基因的5’-UTR和3’-UTR,具體反應(yīng)體系及方法參考鄧秋洋等(2018),第一輪PCR反應(yīng)條件為:94 ℃2 min;94 ℃10 s,72 ℃ 3 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃10 s,70 ℃ 3 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃10 s,68 ℃ 3 min,25個(gè)循環(huán);最后68 ℃ 10 min,取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋 500倍作為模板,進(jìn)行第二輪巢式PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件同上。巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)加A反應(yīng)后連接至pTA2載體,克隆后進(jìn)行序列測(cè)定。
1.2.6 生物信息學(xué)分析使用DNAMAN和APE進(jìn)行DNA序列分析和蛋白質(zhì)翻譯;使用BioEdit和DNAMAN進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì);使用TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè);使用Genomicus(http://www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-91.01/cgi-bin/search.pl)進(jìn)行基因共線(xiàn)性分析;序列分析使用在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank(http://www.ncbi.nih.gov)和Ensembl(http://www.ensembl.org)。
1.2.7 家雞GPR85基因的表達(dá)特征每只家雞取19個(gè)組織,針對(duì)6只家雞不同組織的cDNA模板,通過(guò)qPCR方法檢測(cè)GPR85基因的表達(dá)特征,具體方法參考黃思邈等(2015)和祝國(guó)強(qiáng)等(2017)。qPCR反應(yīng)擴(kuò)增體系如下:cDNA模板6 μL,MilliQ-H2O 9.7 μL,10×buffer 2 μL,dNTPs 0.4 μL,上、下游引物各0.3 μL,熒光染料EvaGreen 1 μL,Easy-Taq酶0.3 μL,總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件如下:94 ℃2 min;94 ℃20 s,62 ℃15 s,72 ℃20 s,40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCT法計(jì)算GPR85基因的相對(duì)表達(dá)水平。
以家雞腦組織cDNA為模板,采用引物(GPR85-U+L)擴(kuò)增GPR85基因編碼區(qū),得到長(zhǎng)度約為1 100 bp的條帶(圖1),與預(yù)期一致。測(cè)序結(jié)果顯示,家雞GPR85基因(GenBank登錄號(hào):MH293604)的編碼區(qū)長(zhǎng)為1 113 bp,可編碼370個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),家雞GPR85蛋白具有經(jīng)典的7次跨膜區(qū),且第三胞內(nèi)環(huán)相對(duì)較長(zhǎng)(圖2)。家雞GPR85與人(99.73%)、小鼠(99.73%)、大鼠(99.73%)、熱帶爪蟾Xenopustropicalis(99.19%)、斑馬魚(yú)(93.80%)GPR85的氨基酸序列一致性極高。人、小鼠、大鼠GPR85的氨基酸序列完全相同,家雞GPR85的氨基酸序列與它們僅有1個(gè)氨基酸的差別,即第一胞外環(huán)中的蘇氨酸(Thr)與天冬酰胺(Asn)之差。將家雞GPR85基因編碼區(qū)cDNA序列與家雞基因組序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)該基因位于家雞第1號(hào)染色體上,通過(guò)染色體共線(xiàn)性分析,發(fā)現(xiàn)家雞GPR85基因與人、小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)GPR85基因?yàn)橹毕低椿?圖3),表明GPR85基因在不同脊椎動(dòng)物中保守存在。
圖1 家雞GPR85基因編碼區(qū)的PCR 擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of the coding region of chicken GPR85
以家雞全腦cDNA為模板,通過(guò)5’和3’-RACE成功獲得家雞GPR85基因的5’-UTR(389 bp)和3’-UTR序列(1 407 bp),通過(guò)與家雞基因組序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)家雞GPR85基因由2個(gè)外顯子構(gòu)成,第1個(gè)外顯子的長(zhǎng)度為214 bp,第2個(gè)外顯子的長(zhǎng)度為2 695 bp,編碼區(qū)位于第2個(gè)外顯子上,2個(gè)外顯子之間有1個(gè)長(zhǎng)為1 508 bp的內(nèi)含子(圖4,圖5)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,家雞GPR85基因mRNA在全腦、垂體、腎上腺、精巢中相對(duì)高表達(dá),而在其他外周組織中表達(dá)水平低(圖6:A)。此外,還檢測(cè)了GPR85基因在腦各區(qū)域的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)GPR85基因mRNA在家雞端腦、中腦、小腦、后腦和下丘腦中均有表達(dá),其中小腦表達(dá)水平最高(圖6:B)。
圖2 家雞GPR85(cGPR85)與人(hGPR85)、小鼠(mGPR85)、大鼠(rGPR85)、熱帶爪蟾(fGPR85)和斑馬魚(yú)(zfGPR85)的氨基酸序列比對(duì)Fig. 2 Amino acid sequence alignment of chicken GPR85 (cGPR85) with that of Homo sapiens (hGPR85),Mus musculus (mGPR85),Rattus norvegicus (rGPR85),Xenopus tropicalis (fGPR85) and Danio rerio (zfGPR85)
陰影表示7次跨膜區(qū)(TM)
The putative 7 transmembrane domains (TMs) were shaded
圖3 GPR85基因在家雞、人、小鼠、大鼠和斑馬魚(yú)中的染色體共線(xiàn)性分析Fig. 3 Synteny analysis of GPR85 gene inGallus gallus domesticus,Homo sapiens,Mus musculus,Rattus norvegicus and Danio rerio
Chr.染色體chromosome
圖4 家雞GPR85基因結(jié)構(gòu)Fig. 4 Structure of chicken GPR85 gene
GPCR可參與眾多生理過(guò)程調(diào)節(jié),如有絲分裂、肌肉收縮、離子通道調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄等(Alexanderetal.,2015)。GPR85作為孤兒受體之一,據(jù)報(bào)道在哺乳動(dòng)物中高度保守(Hellebrandetal.,2000;Jeonetal.,2002),但其在非哺乳類(lèi)脊椎動(dòng)物中的研究幾屬空白。本研究以家雞為模型,首次從家雞腦組織中成功克隆到GPR85基因的全長(zhǎng)cDNA序列,揭示其基因結(jié)構(gòu),探究其在家雞不同組織中的表達(dá)特征。
圖5 家雞GPR85基因全長(zhǎng)cDNA序列和氨基酸序列Fig. 5 The full-length cDNA sequence and amino acid sequence of chicken GPR85 gene
箭頭示內(nèi)含子位置,星號(hào)(*)示終止密碼子TGA
Arrowhead indicates the location of intron 1 and asterisk denotes the stop codon (TGA)
圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析家雞GPR85基因的組織表達(dá)特征Fig. 6 Quantitative real-time PCR assay of GPR85 gene expression in chicken tissues
(A) Br. 全腦,Pi. 垂體,He. 心臟,Li. 肝臟,Sp. 脾臟,Lu. 肺,Ki. 腎臟,Sk. 皮膚,Mu. 肌肉,F(xiàn)at. 脂肪,Pa. 胰腺,Du. 十二指腸,Adr. 腎上腺,Ov. 卵巢,Te. 精巢; (B) Tc. 端腦,Mb. 中腦,Cb. 小腦,Hb. 后腦,Hp. 下丘腦; 以β-actin基因作為內(nèi)參,GPR85基因的相對(duì)表達(dá)水平以倍數(shù)形式表示(以全腦或者端腦為對(duì)照)
(A) Br.whole brain,Pi. pituitary,He. heart,Li. liver,Sp. spleen,Lu. lung,Ki. kidney,Sk. skin,Mu. muscle,F(xiàn)at. fat,Pa. pancreas,Du. duodenum,Adr. adrenal gland,Ov. ovary,Te. testis; (B) Tc. telencephalon,Mb. midbrain; Cb. cerebellum,Hb. hindbrain,Hp. hypothalamus; the mRNA level ofGPR85gene was normalized to that ofβ-actinand expressed as fold difference compared with that of whole brain or telencephalon
本研究首次從全腦組織中成功克隆到家雞GPR85基因的完整編碼區(qū)序列,其編碼1個(gè)長(zhǎng)度為370個(gè)氨基酸的具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的受體蛋白。序列分析顯示家雞GPR85與人(99.73%)、小鼠(99.73%)、大鼠(99.73%)、熱帶爪蟾(99.19%)、斑馬魚(yú)(93.80%)GPR85的氨基酸序列一致性極高。人、小鼠、大鼠的GPR85的氨基酸序列完全相同,家雞GPR85的氨基酸序列與它們僅有1個(gè)氨基酸的差別。共線(xiàn)性分析發(fā)現(xiàn),家雞GPR85基因位于家雞第1號(hào)染色體上,與人、小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)GPR85為直系同源基因。由于在非脊椎動(dòng)物線(xiàn)蟲(chóng)或黑腹果蠅基因組序列中未發(fā)現(xiàn)GPR85同源基因(Matsumotoetal.,2000),這表明GPR85基因可能僅在脊椎動(dòng)物中發(fā)揮重要生理功能。
利用RACE技術(shù)成功獲得了家雞GPR85基因的5’-UTR和3’-UTR序列。家雞GPR85基因的5’-UTR和 3’-UTR序列均與NCBI中預(yù)測(cè)的GPR85基因序列存在長(zhǎng)度上的差異。本研究發(fā)現(xiàn)家雞GPR85基因具有較長(zhǎng)的3’-UTR序列(1 407 bp),暗示其可能參與GPR85mRNA的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位及翻譯的調(diào)節(jié)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,獲得了家雞GPR85基因的組織表達(dá)圖譜,發(fā)現(xiàn)其在全腦(包括端腦、中腦、小腦、后腦和下丘腦)、垂體、腎上腺、精巢中高表達(dá),而在其他組織中具有較低的表達(dá)水平。家雞GPR85基因在腦中的高表達(dá)與哺乳動(dòng)物GPR85基因在腦中的表達(dá)情況相似,暗示GPR85同樣也在家雞腦的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用(Matsumotoetal.,2000,2005)。家雞GPR85基因在精巢中的高表達(dá)也與哺乳動(dòng)物高度一致(Matsumotoetal.,2000),暗示其在精巢中的功能存在一定保守性。而在哺乳動(dòng)物中,尚未有GPR85基因在垂體中高表達(dá)的報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)GPR85基因在垂體組織中的高水平表達(dá),亦暗示其可能參與調(diào)控垂體激素的合成與分泌等。
綜上,本研究首次在非哺乳類(lèi)脊椎動(dòng)物物種(家雞)中,揭示家雞GPR85基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列,并發(fā)現(xiàn)其在全腦、垂體、精巢和腎上腺中高表達(dá)。家雞和哺乳動(dòng)物GPR85基因結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)的高度保守性,提示GPR85在脊椎動(dòng)物腦、精巢等組織中發(fā)揮關(guān)鍵生理作用,值得深入探究。