Six4蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

莫惠婷，蔡紅兵，宋姍姍，涂維，羅榮城

(南方醫(yī)科大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 廣東 廣州 510315)

結(jié)腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是最常見的消化道腫瘤之一，隨著社會(huì)的發(fā)展、人民生活及飲食習(xí)慣的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率不斷上升[1-2].國(guó)家癌癥中心分析，我國(guó)男性和女性結(jié)腸癌發(fā)病率分別為10.46%和9.17%，死亡率在男性中排名第4、女性中排名第5[3].雖然目前對(duì)結(jié)腸癌有多方法聯(lián)合治療，結(jié)腸癌患者術(shù)后仍有約50%可能出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移[4]，總生存時(shí)間不能令人滿意.尋找特異基因及特定靶點(diǎn)成為結(jié)腸癌早期診斷、靶向治療的新方向.

研究表明Six4基因表達(dá)與食管鱗癌[5]、乳腺癌[6]、膀胱癌[7]、非小細(xì)胞肺癌[8]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后有緊密關(guān)系，提示Six4基因可能作為多種腫瘤的致癌基因.但有關(guān)Six4蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的臨床特征及生存時(shí)間的關(guān)系少有報(bào)道，本研究通過檢測(cè)Six4蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況，探索其與結(jié)腸癌臨床特征及預(yù)后的相關(guān)關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片

采用從上海芯超生物科技有限公司購(gòu)買的組織芯片，該芯片包含生存期結(jié)腸癌93例，手術(shù)時(shí)間為2009年11月至2010年5月，癌/癌旁各1個(gè)點(diǎn)，共87例，只有癌組織1個(gè)點(diǎn)，共6例，合計(jì)93例.其中男52例，女41例，年齡23～93歲，平均年齡66.67歲.所有的標(biāo)本都請(qǐng)病理科醫(yī)生進(jìn)行獨(dú)立的診斷與評(píng)估.

1.1.2 主要試劑

一抗為兔抗人Six4抗體(Signalway Antibody公司產(chǎn)品)、小鼠/兔鏈霉卵白素-生物素法檢測(cè)系統(tǒng)(通用SP試劑盒SP-9000))、乙二胺四乙酸二鈉 (ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗原修復(fù)液(pH=9.0,20倍)、PBS(濃度為0.01 mmol/L，pH=7.4)、DAB顯色劑(dako REALTM EnVisionTM detection system, peroxidase/DAB+, rabbit/mouse).

1.2 方法

1.2.1 人結(jié)腸癌基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)分析

對(duì)醫(yī)學(xué)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)(the cancer genome atlas,TCGA)的結(jié)腸癌病理資料進(jìn)行預(yù)后分析，采用Kaplan-Meier生存曲線分析Six4表達(dá)與總生存時(shí)間的關(guān)系，log-rank檢驗(yàn)分析生存曲線的差異，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提取結(jié)腸癌及癌旁組織中的Six4表達(dá)相關(guān)信息，通過Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析癌與癌旁的表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

1.2.2 SP免疫組化法染色

參照文獻(xiàn)[5]的免疫組化方法，Six4一抗(V一抗∶V抗體稀釋液=1∶200)稀釋過夜，次日DAB顯色后，蘇木素染核、分化、封片，鏡下觀察評(píng)分.

1.2.3 結(jié)果判定

Six4蛋白主要表達(dá)于腺體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜出現(xiàn)淡黃色、黃色、棕黃色為陽(yáng)性.按陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)分：<10%為0分，10%～30%為1分，31%～60%為2分，>60%為3分；按染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分.將兩項(xiàng)計(jì)分相乘：乘積≤3為Six4表達(dá)陰性(-)，>3為Six4表達(dá)陽(yáng)性(+).

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 Six4基因高表達(dá)與結(jié)腸癌患者不良預(yù)后相關(guān)

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中選取370例結(jié)腸癌患者的Six4和生存時(shí)間信息，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-meier生存分析(圖1)，結(jié)果顯示Six4高表達(dá)組的生存時(shí)間比Six4低表達(dá)組顯著縮短(P=0.002).

圖1 Six4表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者總生存期的關(guān)系曲線

Fig.1 Curve of relationship betweenSix4expression level and total survival of patients with colorectal carcinoma

2.2 Six4基因在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中提取結(jié)腸癌及癌旁組織中的Six4表達(dá)信息，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析顯示在結(jié)腸癌組織中的Six4表達(dá)較癌旁組織顯著增高(P<0.001)(圖2).利用免疫組化檢測(cè)組織芯片中87例結(jié)腸癌及相應(yīng)癌旁組織，6例單獨(dú)結(jié)腸癌組織中Six4的表達(dá)情況.Six4表達(dá)定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜(圖3).在結(jié)腸癌組織中，有49例患者Six4蛋白高表達(dá)，44例患者低表達(dá)，而在結(jié)腸癌癌旁組織中，79例患者Six4蛋白低表達(dá)，只有8例高表達(dá)(表1)，2統(tǒng)計(jì)分析顯示，Six4蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)(52.7%)顯著高于癌旁組織(9.2%)，P<0.001，可見Six4蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)顯著升高(表1).

圖2 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中Six4的表達(dá)水平

Fig.2 The expression of Six4 in colon cancer tissues and adjacent tissues

表1 Six4在結(jié)腸癌組織與癌旁組織的表達(dá)水平

2.3 Six4蛋白與結(jié)腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)在93例結(jié)腸癌組織中，Six4蛋白的表達(dá)與病理分期(P=0.020)、腫瘤大小(P=0.034)、MSH6表達(dá)水平(P=0.035)呈正相關(guān)，病理分期較晚、腫瘤體積較大、MSH6高表達(dá)的患者Six4表達(dá)顯著升高.與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、Ki67表達(dá)水平、P53表達(dá)水平、MSH2表達(dá)水平等無(wú)明顯相關(guān)性(表2).

2.4 Six4表達(dá)是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素

組織芯片數(shù)據(jù)用COX單因素回歸分析結(jié)果顯示，病理分期(P=0.001)、腫瘤大小(P=0.011)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000)、TNM分期(P=0.001)及Six4的表達(dá)(P=0.028)與結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間呈顯著相關(guān)性.為了確定Six4是否為結(jié)腸癌的獨(dú)立預(yù)后因子，將病理分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、MSH6納入多因素回歸分析，結(jié)果顯示Six4的表達(dá)水平(P=0.029)可以作為結(jié)腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素.

表2 Six4在結(jié)腸癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

Table 2 Relationship between clinical characteristics and Six4 levels in individuals with colorectal carcinoma

nSix4(n=49)(n=44)P5223290.065412615/<654221210.637≥655128238947420.912422ⅠⅡ7837410.020Ⅱ～ⅢⅢ15123d/mm<53413210.034≥55936235024260.912432518TNMⅠ&Ⅱ4621250.178Ⅲ&Ⅳ472819KI675027230.784432221P534422220.622492722MSH2161060.387773938MSH63825130.035552431

表3 總生存時(shí)間的單因素和多因素Cox分析Table 3 Summary of univariate and multivariate Cox regression analysis of OS

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病與結(jié)腸息肉病、慢性潰瘍性結(jié)腸炎、高脂肪和低纖維素飲食習(xí)慣及遺傳因素等多種因素有關(guān).結(jié)腸癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，最新的研究全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示40種新的與結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)的遺傳變異[9]，可見其發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，需要多階段、多步驟及多基因的參與[10].

同源異性框基因家族(homebox gene)是一類高度保守的DNA序列，根據(jù)其同源異形域(homeo-domain，HD)差異和額外序列不同，分為Hox、Msx、Pax、Six等幾個(gè)不同家族，在生物發(fā)育和分化中起到重要的調(diào)控作用，是一種在進(jìn)化上高度保守的基因序列，可特異性地調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，具有特定的時(shí)空表達(dá)模式.有報(bào)道指出，同源異形框基因與細(xì)胞惡變、惡性增殖、出現(xiàn)侵襲、轉(zhuǎn)移特性相關(guān)，可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11].

Six家族共有6種不同基因[12]，當(dāng)6個(gè)基因異常表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞異常增殖、血管生成、侵襲和遷移而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、腫瘤進(jìn)展.Six1可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌增殖和侵襲，Six2可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞中ZEB1表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，與結(jié)腸癌不良預(yù)后密切相關(guān)；Six3表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移.Six4作為Six家族成員之一，編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞發(fā)育分化增殖中起關(guān)鍵的調(diào)控作用，可調(diào)節(jié)Na+/K+-ATP酶亞基的表達(dá)[13]；另外可與Six1基因協(xié)同作用，調(diào)節(jié)參與各種器官形成的相關(guān)靶基因，包括肌肉[14]、腎臟[15]、性腺[16]、神經(jīng)節(jié)[17]、味蕾[18]、嗅覺基板[19]和大腦[20].Six4基因參與到胚胎發(fā)育過程中肌纖維分化[21]，誘導(dǎo)ATP2A1、MYL1和TNNT3基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活肌細(xì)胞分化.同時(shí)也有研究指出Six4參與腫瘤細(xì)胞分化、侵襲、遷移等過程[22].在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了，Six4基因可影響肝細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移、增殖和干性的維持.Six4是Mir-203a的直接靶點(diǎn)，Six4過度表達(dá)使mir-203a表達(dá)下調(diào)[7],與膀胱癌腫瘤發(fā)生密切相關(guān).另外Six4可能是Mir-145靶基因，參與調(diào)控肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲等惡性能力[23].本研究利用免疫組化法對(duì)結(jié)腸癌組織芯片做Six4蛋白表達(dá)研究，結(jié)合臨床特征數(shù)據(jù)分析，初步揭示了Six4蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，與病理分期、腫瘤大小、MSH6表達(dá)水平相關(guān)，可作為結(jié)腸癌患者獨(dú)立預(yù)后因素，提示Six4表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，為進(jìn)一步研究Six4基因在結(jié)腸癌中作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).