人血管緊張素Ⅱ2型受體AT2R重組細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定

陳惠瑩，毛瑩瑩，裴娜娜，顏仁和，萬(wàn)鵬飛，李紅衛(wèi)

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院， 廣東 廣州 510515； 2.暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科， 廣東 廣州 510163；3. 廣州伯尼茲生物科技有限公司， 廣東 廣州 510663)

前列腺癌是威脅當(dāng)今老年男性健康的惡性疾病之一，在男性常見(jiàn)腫瘤中排第2位，同時(shí)也是癌癥相關(guān)死亡的第5大常見(jiàn)原因[1].在中國(guó)，前列腺癌的發(fā)病率雖遠(yuǎn)低于西方國(guó)家，但近年前列腺癌早期診斷檢查普及，檢出率與發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，占泌尿系統(tǒng)腫瘤第2位[2].

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)由腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血管緊張素原和多種血管緊張素肽組成，是體內(nèi)調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)、體液平衡和血壓的重要激素系統(tǒng).腎素催化血管緊張素原水解最終產(chǎn)生的血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，AngⅡ通過(guò)1型(angiotensin Ⅱtype 1 receptor, AT1R)和2型(angiotensin Ⅱtype 2 receptor, AT2R)受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用.近年研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵的作用[3]，當(dāng)與AT1R結(jié)合時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移、血管生成進(jìn)而引起腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移；與AT2R結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生抑制腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡的作用[4-5].在大多數(shù)環(huán)境狀態(tài)下，AT2R都表現(xiàn)出與AT1R相對(duì)立的效應(yīng).近年來(lái)，一種新型AT2R激動(dòng)劑Compound 21(C21)為AT2R的研究提供了新的思路.C21是一種非肽類(lèi)AT2R特異性激動(dòng)劑，在體內(nèi)外可與AT2R特異性結(jié)合發(fā)揮類(lèi)似于AngⅡ的生理學(xué)效應(yīng)[6].由于AT2R在大部分腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平較低，且在前列腺癌和胰腺癌的研究結(jié)果中顯示，隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，AT2R的表達(dá)水平顯著降低[7]，使C21在抗腫瘤中的應(yīng)用受到限制，也使其他AT2R非特異性激動(dòng)劑受到AT1R的干擾.

慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體，具有轉(zhuǎn)染效率好、感染效率較高、基因表達(dá)穩(wěn)定的特點(diǎn).重組慢病毒可將攜帶的外源基因高效整合至宿主細(xì)胞基因組中，使外源基因在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)[8].本研究在課題組前期研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建人AT2R重組慢病毒表達(dá)載體，并感染PC-3、DU145細(xì)胞建立hAT2R過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系，探討C21等AT2R激動(dòng)劑對(duì)前列腺癌的作用與機(jī)制，為探索C21作為新型前列腺癌治療藥物提供細(xì)胞模型與實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PC-3細(xì)胞株、DU145細(xì)胞株及pLV-CMV-IRES-eGFP質(zhì)粒由南方醫(yī)科大學(xué)生物治療研究所保存.

1.1.2 試劑

感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京康潤(rùn)科技有限公司；NheI限制性內(nèi)切酶、MluI限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真PCR酶PrimerSTAR、SYBR Premix Ex TaqTM 均購(gòu)自Takara公司；聚醚酰亞胺(polyetherimide，PEI)、胎牛血清購(gòu)自Sigma公司；DMEM、F-12k細(xì)胞培養(yǎng)基與青霉素-鏈霉素購(gòu)自ThermoFisher公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本同仁公司；抗兔AT2R一抗購(gòu)于北京奧維亞生物技術(shù)有限公司；抗兔GAPDH一抗購(gòu)于bioworld公司，HRP標(biāo)記抗羊兔二抗為杭州弗德生物科技有限公司產(chǎn)品.

1.1.3 儀器設(shè)備

Veriti 96 well Thermal Cycler PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems；分光光度計(jì)購(gòu)自Bio-rad;熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS；5910型小型高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；7500熒光定量PCR儀、凝膠成像儀、高速離心機(jī)購(gòu)自ThermoFisher公司.

1.1.4 培養(yǎng)基

體積分?jǐn)?shù)為10% FBS DMEM培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基中加入FBS至體積分?jǐn)?shù)為10%，加入青霉素-鏈霉素細(xì)胞培養(yǎng)雙抗至終體積分?jǐn)?shù)為1%，混勻后于4℃保存?zhèn)溆?；體積分?jǐn)?shù)為10% FBS F-12k培養(yǎng)基：F-12k培養(yǎng)基中加入FBS至體積分?jǐn)?shù)為10%，加入青霉素-鏈霉素細(xì)胞培養(yǎng)雙抗至終質(zhì)量濃度為1%，混勻后于4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 方法

1.2.1 目的基因及引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中hAT2R基因序列合成目的基因序列，在5′及3′端分別加入NheI及MluI酶切位點(diǎn)，合成的hAT2R基因克隆至pUC57載體中.同時(shí)設(shè)計(jì)合成hAT2R引物序列Forward：5′-CGGAATTCATGAGCTGCGTTAATCC -3′，Reverse：5′-AACTGCAGTTAAGACACAAAGGTCTCCA-3′，以上目的基因及引物委托美吉生物科技有限公司合成.

1.2.2 載體質(zhì)粒的構(gòu)建

將pUC57-hAT2R和pLV-CMV-IRES-eGFP質(zhì)粒用NheI和MluI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠回收得到目的基因hAT2R片段和pLV-CMV-IRES-eGFP載體大片段，用T4 DNA連接酶將回收的目的片段與載體連接并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)，挑取單克隆菌落并提取質(zhì)粒.獲得含有目的基因hAT2R的重組質(zhì)粒命名為pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定.

1.2.3 重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染

使用PEI轉(zhuǎn)染法將慢病毒載體質(zhì)粒pLV-CMV-IRES-eGFP和含有目的基因的慢病毒載體連接質(zhì)粒pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP分別轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，同時(shí)將正常培養(yǎng)的293T細(xì)胞作為對(duì)照，分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h使用熒光顯微鏡觀察目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況.

1.2.4 慢病毒載體包裝、純化、濃縮及滴度測(cè)定

采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將鑒定正確的慢病毒重組質(zhì)粒與慢病毒包裝所必須的輔助質(zhì)粒psPAX2和VSVG共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞.轉(zhuǎn)染細(xì)胞使用完全培養(yǎng)基在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清液并純化.純化后病毒液經(jīng)10 KD濃縮柱離心濃縮至5 mL.使用RT-PCR法測(cè)定病毒滴度，并于-80 ℃保存.

1.2.5 建立hAT2R穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC-3及DU145兩株前列腺癌細(xì)胞1.00×106/孔均勻鋪于6孔板中，置入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h.第2天，去除孔內(nèi)原培養(yǎng)基，以MOI=1 000加入pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP病毒液，同時(shí)加入聚凝胺(polybrene)使其終質(zhì)量濃度為8 mg/L，將6孔板放入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，觀察細(xì)胞熒光情況.使用細(xì)胞流式分選法將感染細(xì)胞分選并接種于96孔板，培養(yǎng)10 d后挑選96孔板中僅含有1個(gè)細(xì)胞團(tuán)的熒光細(xì)胞孔即單克隆細(xì)胞株，將其傳代并擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的單克隆細(xì)胞系分別命名為PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R.

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)hAT2R的基因表達(dá)

用RNAiso Plus提取PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)得RNA濃度.以每反應(yīng)體系1 μg加入RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作獲得cDNA.以β-actin作為內(nèi)參，使用SYBR Green法檢測(cè)目的基因表達(dá).同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組作為陰性對(duì)照.

1.2.7 Western blot檢測(cè)重組細(xì)胞系hAT2R的蛋白質(zhì)水平表達(dá)

使用RIPA細(xì)胞裂解液分別提取PC-3、DU145及PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R細(xì)胞總蛋白質(zhì)，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中AT2R表達(dá)量，蛋白質(zhì)條帶灰度分析使用ImageJ軟件進(jìn)行.

2 結(jié)果

2.1 pLV-CMV-eGFP-hAT2R載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果

將hAT2R基因克隆至慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pLV-CMV-IRES-eGFP中，NheI及MluI雙酶切重組質(zhì)粒pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP質(zhì)粒鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1)，小片段與原始目的基因質(zhì)粒片段相同，約為1 200 bp左右，符合預(yù)期，且大片段與原始載體酶切片段相同.PCR鑒定獲得130 bp左右片段(圖2).質(zhì)粒測(cè)序鑒定無(wú)突變.以上結(jié)果證明目的基因慢病毒載體連接質(zhì)粒pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP構(gòu)建成功.

M：DL2000DNA 標(biāo)記物；1：pLV-CMV-IRES-eGFP；2：pUC57-hAT2R-kana/(NheI &MluI)；3～8：pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP/(NheI&MluI).

M:DL2000DNA marker; 1:pLV-CMV-IRES-eGFP;2:pUC57-hAT2R-kana/(NheI&MluI);3～8:pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP/(NheI&MluI).

圖1pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP的酶切鑒定結(jié)果

Fig.1 Restrction enzyme digestion analysis ofpLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP

M：DL2000DNA 標(biāo)記物；1～3：pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.

M:DL2000DNA marker;1～3:pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.

圖2pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFPPCR鑒定結(jié)果

Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis ofhAT2Ramplified by PCR

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光表達(dá)情況

將慢病毒載體質(zhì)粒pLV-CMV-IRES-eGFP與目的基因慢病毒載體連接質(zhì)粒pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并與未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照，轉(zhuǎn)染后24、48、72 h在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)(圖3).RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞hAT2R表達(dá)(圖4).結(jié)果證明慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，目的基因蛋白在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá).

圖3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24、48、72 h熒光

對(duì)照組：HEK293T cell；eGFP：plv-CMV-IRES-eGFP；hAT2R：pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.1)對(duì)照組與eGFP組無(wú)差異；2)eGFP組與hAT2R組差異顯著，P≤0.01.

Control:HEK293T cell; eGFP:plv-CMV-IRES-eGFP; hAT2R:pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.1)No difference between the control group and the eGFP group; 2) difference between the eGFP group and the hAT2R group,P≤0.01.

圖4 RT-PCR檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞hAT2R表達(dá)

Fig.4 Detection of hAT2R expression in HEK293T cells by RT-PCR

2.3 單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建

選擇兩株前列腺癌細(xì)胞PC-3及DU145細(xì)胞，以MOI=1 000感染48 h后，使用細(xì)胞流式分選技術(shù)將成功表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞分選至96孔培養(yǎng)板中，每孔1個(gè)細(xì)胞.培養(yǎng)10 d后，熒光顯微鏡下觀察96孔板細(xì)胞，每株細(xì)胞各挑選5個(gè)熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的陽(yáng)性單克隆(圖5)，并擴(kuò)大培養(yǎng)于6孔板中.最終挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好的陽(yáng)性單克隆持續(xù)傳代至30代并保存，分別命名為PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R.

2.4 重組細(xì)胞系hAT2R的表達(dá)水平檢測(cè)

在重組細(xì)胞系傳代培養(yǎng)至第30代時(shí)，收集細(xì)胞，RNAiso Plus試劑提取細(xì)胞總RNA，同時(shí)提取未感染細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用RT-PCR檢測(cè)目的基因hAT2R表達(dá).重復(fù)3次所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(圖6).重組細(xì)胞系PC-3-hAT2R中hAT2R基因表達(dá)是未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的789倍，DU145-hAT2R中hAT2R基因表達(dá)是未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的621倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.同時(shí)分別提取PC3、DU145細(xì)胞及兩株重組細(xì)胞系細(xì)胞總蛋白質(zhì)，使用Western blot法檢測(cè)hAT2R蛋白質(zhì)水平表達(dá)(圖7)，重組細(xì)胞系中目的基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著升高.

A1～5: PC-3-hAT2R單克隆白光；B1～5: PC-3-hAT2R單克隆熒光；C1～5: DU145-hAT2R單克隆白光；D1～5： DU145-hAT2R單克隆熒光

A1～5: bright-field image of PC-3-hAT2R; B1～5: fluorescence of PC-3-hAT2R; C1～5: bright-field image of DU145-hAT2R; D1～5:fluorescence of DU145-hAT2R.

圖5 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞圖

Fig.5 Monoclonal cell of PC-3-hAT2R and DU145-hAT2R

1)PC-3-hAT2R組較PC-3組hAT2R基因表達(dá)水平顯著上升，P≤0.05；2)DU145-hAT2R組較DU145組hAT2R基因表達(dá)水平顯著上升，P≤0.05.

1)Significantly difference between thePC-3-hAT2Rgroup and the PC-3 group,P≤0.05; 2)significantly difference between theDU145-hAT2Rgroup and the DU145 group,P≤0.05.

圖6 RT-PCR檢測(cè)重組單克隆細(xì)胞系hAT2R表達(dá)

Fig.6 Detection of hAT2R expression in recombinant monoclonal cell line by RT-PCR

圖7 Western blot檢測(cè)重組單克隆細(xì)胞系hAT2R蛋白水平表達(dá)

Fig.7 Detection of hAT2R expression in recombinant monoclonal cell line by Western blot

2.5 重組細(xì)胞系hAT2R受體功能檢測(cè)

使用濃度為10 μmol/L AT2R激動(dòng)劑CGP42112分別處理PC-3、DU145細(xì)胞及PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R重組細(xì)胞系，24 h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，兩株細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與PC-3、DU145細(xì)胞相比重組細(xì)胞系PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R細(xì)胞存活率明顯下降，同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，PC-3、DU145細(xì)胞經(jīng)CGP42112處理后，細(xì)胞呈明顯增殖趨勢(shì)(圖8).

A:1)PC-3細(xì)胞中，CGP42112組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力升高，P≤0.05；2) PC-3-hAT2R細(xì)胞中，CGP42112組較對(duì)照組細(xì)胞活力降低，P≤0.05；3)CGP42112處理后，PC-3-hAT2R組較PC-3組細(xì)胞活力顯著降低，P≤0.05.

B:1)DU145細(xì)胞中，CGP42112組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力升高，P≤0.05；2) DU145-hAT2R細(xì)胞中，CGP42112組較對(duì)照組細(xì)胞活力降低，P≤0.05；3)CGP42112處理后，DU145-hAT2R組較DU156組細(xì)胞活力顯著降低，P≤0.05.

A:1)PC-3 cell: control and CGP42112-treated,P≤0.05;2) PC-3-hAT2R cell: control and CGP42112-treated,P≤0.05;3) CGP42112-treated: PC-3-hAT2R cell and PC-3 cell,P≤0.05.

B:1)DU145 cell: control and CGP42112-treated,P≤0.05;2) DU145-hAT2R cell: control and CGP42112-treated,P≤0.05;3) CGP42112-treated: DU145-hAT2R cell and DU145 cell,P≤0.05.

圖8 CCK-8法檢測(cè)CGP42112處理24 h后各組細(xì)胞活力

Fig.8 Detection of cell viability in CGP42112-treated cells by CCK-8

3 討論

AngⅡ的兩種受體AT1R和AT2R是具有30%相似序列的跨膜糖蛋白[9].其中AT2R是胚胎時(shí)期AngⅡ的主要受體，調(diào)節(jié)胚胎期組織、器官的分化和發(fā)育，出生后表達(dá)量顯著下降，僅在機(jī)體的大腦某些區(qū)域、腎上腺、心臟、腎臟某些結(jié)構(gòu)及子宮肌層和卵巢等特定器官表達(dá)，且表達(dá)量較低，使AT2R的相關(guān)研究受限.現(xiàn)階段研究顯示，與AT1R的有害性相反，AT2R是RAS的保護(hù)性分支，且常常與AT1R相拮抗，可能是機(jī)體的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[10].近年來(lái)，AT1R在多種腫瘤中的促細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成和加速惡性轉(zhuǎn)化的作用已得到證實(shí)，而其拮抗劑則表現(xiàn)為抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[11].AT2R與AT1R相對(duì)立的效應(yīng)使其作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)也獲得越來(lái)越多的關(guān)注.已有研究發(fā)現(xiàn)，AT2R在前列腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，可能與AT2R內(nèi)源性表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡相關(guān)[12].

新型非肽類(lèi)AT2R激動(dòng)劑C21，由一種非選擇性AT1R/AT2R激動(dòng)劑L-162，313改造而來(lái)，對(duì)AT2R的Ki值(濃度為0.4 nmol/L)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)AT1R的Ki值(濃度大于10 μmol/L)，可特異性激活A(yù)T2R[13].已有大量研究證實(shí)，C21與AT2R結(jié)合能夠有效發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)包括抗炎、緩解胰島素抵抗、降低氧化應(yīng)激、舒張血管、抵抗血管和心肌纖維化、保護(hù)神經(jīng)元等[14-15].C21作為一種新型AT2R激動(dòng)劑，在治療肺纖維化的研究已經(jīng)入一期臨床實(shí)驗(yàn)[15].此外，CGP42112以及肽類(lèi)AT2R激動(dòng)劑AngⅡ也常用于AT2R的研究[16].AngⅡ與AT1R和AT2R均可結(jié)合發(fā)揮作用，導(dǎo)致其激活A(yù)T2R的特異性較差.有研究指出CGP42112對(duì)AT2R的激活位點(diǎn)與AngⅡ并不完全相同，其功能不能完全被AT2R拮抗劑PD123319抑制[17-18]，因此CGP42112激活A(yù)T2R的特異性也較低，所以，使用CGP42112處理PC-3、DU145細(xì)胞24 h后表現(xiàn)促細(xì)胞增殖作用，可能激活了AT1R所致.具有高特異性的新型AT2R激動(dòng)劑C21能否用于前列腺癌的治療，以及其激活A(yù)T2R在前列腺腫瘤細(xì)胞中的作用及其機(jī)制仍有待探究.

本研究利用人AT2R作為目的基因，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體.慢病毒是目前分子及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)中十分高效的工具，在基因重組方面有著許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，相比于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒的可感染宿主廣泛，對(duì)于一些較難感染的細(xì)胞也可有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，可攜帶5kb，甚至更長(zhǎng)的目的基因序列，并能夠?qū)⒛康幕蛘先胨拗骷?xì)胞基因，使目的基因在靶細(xì)胞中獲得持續(xù)高效穩(wěn)定表達(dá)[19-20].本研究在使用慢病毒重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的基礎(chǔ)上，選取兩株前列腺癌細(xì)胞構(gòu)建hAT2R基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，并使用RT-PCR定量檢測(cè)及Western blot分別檢測(cè)重組細(xì)胞系中目的基因hAT2R在基因及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，同時(shí)使用CGP42112檢測(cè)了重組細(xì)胞系的受體功能，檢測(cè)結(jié)果證明重組細(xì)胞系構(gòu)建成功，PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R兩株重組細(xì)胞系為進(jìn)一步研究C21及非特異性AT2R激動(dòng)劑對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制提供了可靠便捷的工具.

綜上，本研究成功構(gòu)建了hAT2R過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系，為研究AT2R激動(dòng)劑C21等對(duì)前列腺癌的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).