腸型與彌漫型胃癌中Sonic hedgehog與Wnt3A/β-catenin的表達(dá)

劉先勇, 王建寧, 仇偉, 李加虎, 周宇, 王玉紅, 張若梅, 孟春芹

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院 1.中西醫(yī)結(jié)合科， 2.消化內(nèi)科， 3.病理科， 4.內(nèi)鏡室， 5.中心實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 211100)

勞倫(Lauren)分型[1]把胃癌分為腸型和彌漫型.腸型胃癌(intestinal-type gastric cancer，IGC)的科雷亞(Correa)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[2]序貫發(fā)生正確性已被證實(shí)[3]，但此進(jìn)程的分子生物學(xué)機(jī)制仍不明晰；在彌漫型胃癌(diffuse-type gastric cancer, DGC)發(fā)病機(jī)制的研究中，除E-鈣黏蛋白(E-cadherin，CDH1)的基因突變致遺傳性DGC發(fā)病外，其他獲得的研究成果讓人失望[4].音猬因子(sonic hedgehog，Shh)信號(hào)通路與經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路類似，不僅能促進(jìn)胃的胚胎發(fā)育，為穩(wěn)定胃腺體內(nèi)環(huán)境所必需[5]，也與胃癌的發(fā)病關(guān)系密切.在國(guó)內(nèi)外研究Shh、Wnt3A/ β連環(huán)蛋白(β-catenin)在胃癌中表達(dá)特點(diǎn)的報(bào)道中，多未把胃癌區(qū)分為IGC和DGC[6-8]，在少有的區(qū)分了IGC[9]或DGC[10]的文獻(xiàn)中，鮮有研究二者在兩種胃癌中表達(dá)的相關(guān)性.本研究旨在探討蛋白Shh、Wnt3A/β-catenin及分泌型卷曲相關(guān)蛋白-1(secreted frizzled-related protein-1，Sfrp1)在IGC和DGC中表達(dá)特點(diǎn)及相關(guān)性，探討這兩種胃癌發(fā)病的分子機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

按Lauren病理分型嚴(yán)格區(qū)分IGC和DGC[1]，IGC選取腺管結(jié)構(gòu)明顯的高、中分化腺癌，對(duì)于腺管不明顯的低分化腺癌則不予入選.DGC選擇癌細(xì)胞散在分布、無(wú)或極少腺體形成的標(biāo)本.黏液腺癌若腺體明顯，則歸屬I(mǎi)GC，若以印戒細(xì)胞癌為主則歸屬DGC.剔除混合型胃癌.

1.2 標(biāo)本選擇

隨機(jī)選取114例2015年11月至2018年12月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院內(nèi)鏡室和病理科獲得的慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG；作為對(duì)照組)、DGC及IGC的病理標(biāo)本.其中30例CSG患者年齡35～76歲，男18例，女12例，平均年齡(55.867±9.975)歲；42例IGC患者年齡40～80歲，男26例，女16例，平均年齡(65.097±13.505)歲；42例DGC患者年齡35～78歲，男28例，女14例，平均年齡(55.561±11.384)歲.3組間年齡比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=8.165，P<0.001).IGC患者年齡較DGC、CSG患者年齡大，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.001).各組間性別分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

1.3 主要試劑與儀器

兔抗人Shh、Wnt3A、β-catenin一抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司.蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中使用的電泳儀及顯影儀分別購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司以及ProteinSimple公司.

1.4 方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)方法

使用免疫組化Max Vision法檢測(cè)3組標(biāo)本中Shh、Wnt3A/β-catenin及 Sfrps1蛋白的表達(dá)情況.具體步驟按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作.以PBS代替一抗作為空白對(duì)照.

1.4.2 蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)分析

于3組標(biāo)本中加入蛋白裂解液按步驟提取總蛋白.采用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)法檢測(cè)蛋白濃度.分別上樣體積10 μL蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，體積分?jǐn)?shù)為10%)電泳，電泳后將蛋白濕法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上.將膜置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜.洗膜緩沖液(tris buffered saline Tween，TBST)洗膜后加入二抗室溫孵育.再次洗膜后加入顯影劑，上機(jī)檢查進(jìn)行條帶分析，定量檢測(cè)各組蛋白表達(dá)水平.β-actin 作為內(nèi)參.重復(fù)3次.

1.4.3 染色評(píng)估方法

蛋白陽(yáng)性胞膜、胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)淡黃、棕黃色或棕褐色顆粒.具體參考本課題組相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)等[11]判別方法：在高倍鏡下(×200)觀察每個(gè)標(biāo)本的5個(gè)隨機(jī)選擇的視野.①染色強(qiáng)度半定量分級(jí)：無(wú)色為0分，淡黃為1分，棕黃為2分，棕褐為3分.②細(xì)胞陽(yáng)性百分比評(píng)分： 0分(陽(yáng)性率<1%)，1分(1%≤陽(yáng)性率<30%)，2分(30%≤陽(yáng)性率<50%)，3分(陽(yáng)性率≥50%).兩項(xiàng)積分相乘獲得蛋白的表達(dá)分?jǐn)?shù)：0～1為陰性(-)，2～4為弱陽(yáng)性(+)，5～8為陽(yáng)性(++)，9～12為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)≥2分.

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí)采用單因素方差分析；非正態(tài)性數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)(多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn))；等級(jí)資料相關(guān)性采用Spearman進(jìn)行分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 Shh蛋白在3組中的表達(dá)

2.1.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Shh蛋白在3組中的表達(dá)

Shh主要表達(dá)在細(xì)胞漿、細(xì)胞膜.在CSG中Shh多陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1A、表1)；在IGC中，Shh大部分表達(dá)減少，呈弱陽(yáng)性表達(dá)，部分甚至不表達(dá)(圖1B、表1)，但也有極少數(shù)強(qiáng)表達(dá)；在DGC中，Shh多呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1C、表1).3組之間的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Kruskal-Wallis檢驗(yàn)H=46.064，P<0.001).與CSG組比較，Shh在IGC組表達(dá)顯著減少(P<0.001)，但在DGC組表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與IGC組比較，Shh在DGC組表達(dá)顯著增強(qiáng)，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001).

表1 Shh蛋白在3組中表達(dá)的比較

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Shh、Wnt3A/β-catenin及Sfrp1在3組中表達(dá)情況(×200)

2.1.2 Western blotting法檢測(cè)Shh蛋白在3組中的表達(dá)

Shh在3組之間的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=739.731，P<0.001).與CSG組比較，Shh蛋白在IGC組表達(dá)水平顯著減少，但在DGC組表達(dá)水平顯著增高；與DGC組比較，Shh蛋白在IGC中表達(dá)水平顯著降低.兩組間比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001,圖2).

1)IGC組、DGC組與CSG組比較，P<0.001；IGC組與DGC組比較，P<0.001.
1)IGCgroup and DGCgroup were compared with CSG group,P<0.001; IGC group was compared with DGC group,P<0.001.

圖2 Western blotting法檢測(cè)Shh蛋白在3組中表達(dá)水平

Fig.2 Western blotting to detect the expression of Shh protein in three groups

2.2 β-catenin蛋白在3組中的表達(dá)

2.2.1 免疫組化法檢測(cè)β-catenin在CSG及IGC中的定位表達(dá)

在CSG中，可以明顯觀察到β-catenin主要表達(dá)在細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)不染色或局部淡染，胞核一般不染色(圖1D)；在IGC中，可見(jiàn)明顯的胞質(zhì)、胞核異位表達(dá)(圖1E).

2.2.2 免疫組化法檢測(cè)β-catenin在3組中的表達(dá)

β-catenin在3組之間的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Kruskal-Wallis檢驗(yàn)H=38.629，P<0.001).與CSG組比較，β-catenin在IGC組表達(dá)水平顯著增高，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖1E，表2)；與CSG組比較，β-catenin在DGC組表達(dá)顯著減少，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001).β-catenin在一些DGC中甚至不表達(dá)(圖1F、表2).與DGC組比較，β-catenin在IGC組表達(dá)顯著增強(qiáng)，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001).

表2 免疫組織化法檢測(cè)β-catenin蛋白在3組中表達(dá)的比較

2.2.3 Western blotting法檢測(cè)β-catenin在3組中的表達(dá)

β-catenin在3組之間的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=253.540，P<0.001).與CSG組比較，β-catenin蛋白在IGC組表達(dá)水平顯著增高，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)；與CSG組比較，β-catenin蛋白在DGC組表達(dá)水平顯著降低，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)；與DGC組比較，β-catenin蛋白在IGC組表達(dá)水平顯著增高，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001).

2.3 Wnt3A與Sfrp1在3組中的表達(dá)特點(diǎn)

Wnt3A(圖1G～I(xiàn))與Sfrp1(圖1J～L)在3組中多不表達(dá).

2.4 Shh蛋白與β-catenin蛋白在3組中表達(dá)的相關(guān)性

Shh與β-catenin在CSG中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.365，P<0.005)；Shh與β-catenin在IGC、DGC中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.507，P<0.001、r=-0.747，P<0.001).

3 討論

IGC的Correa級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要包括CSG→慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)伴腸上皮化生(intestinal metaplasia, IM)→IGC.在此發(fā)展進(jìn)程中，形態(tài)發(fā)生素Shh發(fā)生了深刻的變化.Shh可由胃上皮細(xì)胞和壁細(xì)胞分泌，不僅精準(zhǔn)調(diào)節(jié)胃的病理生理[5]，且為胃腺體分化的核心蛋白[12].在CSG中，Shh蛋白廣泛地表達(dá)在胃腺體中.在CAG及IM中，研究表明[11-12]：Shh蛋白表達(dá)顯著減少.在IGC中，本試驗(yàn)結(jié)果提示：Shh低表達(dá)，有一些甚至不表達(dá)，這與Lee等[13-14]研究結(jié)果不同，但與Fukaya等[15]研究結(jié)論一致.Shh在Correa級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的這一變化可能導(dǎo)致了相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)，進(jìn)而引起了胃腺體分化障礙，參入IGC發(fā)病的早期階段[16].Shh在DGC中表達(dá)的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道并不多見(jiàn)，Lee等[14]研究認(rèn)為：Shh 在IGC中表達(dá)比在DGC中更強(qiáng)，這與本次研究結(jié)果不同，本次研究結(jié)果提示，Shh在DGC中表達(dá)顯著增多，與Fukaya等[15]研究結(jié)論類似.DGC可能源于胃干細(xì)胞[17]或骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞[5]，后者可過(guò)表達(dá)Shh蛋白[12,18]導(dǎo)致Shh信號(hào)通路的異常激活，參與DGC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[12].

1)IGC組、DGC組與CSG組比較，P<0.001；IGC組與DGC組比較，P<0.001.1)IGCgroup and DGCgroup were compared with CSG group, P<0.001; IGC group was compared with DGC group, P<0.001.

經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路異常激活可導(dǎo)致細(xì)胞癌變，致癌常由Wnt3A等分泌性糖蛋白異常表達(dá)觸發(fā)[19]，實(shí)驗(yàn)中觀察到：Wnt3A在IGC及DGC及正常胃黏膜中多無(wú)表達(dá)，說(shuō)明Wnt3A雖為經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中的重要蛋白，對(duì)細(xì)胞的分化成熟有重要作用，但并未作為分泌蛋白參與胃癌進(jìn)程.β-catenin為經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中重要的多功能蛋白，不僅是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附[20].在CSG中，β-catenin主要表達(dá)在胃黏膜細(xì)胞膜上，發(fā)揮細(xì)胞間的黏附作用，腸表型胃癌伴隨著胞膜的β-catenin向胞質(zhì)/胞核異位變化[20]，并伴β-catenin蛋白水平表達(dá)明顯增加.而β-catenin蛋白在DGC中顯著減少，有一些甚至不表達(dá).這與之前的報(bào)道：“在IGC中，β-catenin細(xì)胞核表達(dá)和mRNA 水平升高比在DGC中更常見(jiàn)”相似[9,21].

本研究發(fā)現(xiàn)，Shh和β-catenin在IGC及DGC中表達(dá)呈負(fù)相關(guān).在IGC中，伴隨Shh的減少，β-catenin出現(xiàn)核異位，同時(shí)表達(dá)增多.究其原因可能是Shh的減少引起E-鈣黏蛋白表達(dá)的減少，進(jìn)一步導(dǎo)致β-catenin向胞核的移位激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路[18,22].在DGC中，Shh表達(dá)增多，β-catenin表達(dá)減少，有一些甚至不表達(dá).理論上講，Shh信號(hào)作用于Wnt信號(hào)通路上游，可通過(guò)增加Sfrp1的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而減少了β-catenin核表達(dá)，負(fù)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)活性[23].但實(shí)驗(yàn)中，這種推測(cè)未被證實(shí).

Yanai等[6]較早觀察到Shh和Wnt兩個(gè)信號(hào)通路相互作用，形成一個(gè)調(diào)節(jié)環(huán)[23].胃腺體中或存在Shh-Wnt信號(hào)通路動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制[12,24]，二者平衡失調(diào)可能在胃癌相關(guān)過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[23]，與IGC及DGC發(fā)病有密切關(guān)系.從CSG到IGC發(fā)展進(jìn)程中，Shh減少，可能打破了Shh與Wnt兩個(gè)信號(hào)通路在胃腺體中的動(dòng)態(tài)平衡，β-catenin表達(dá)水平增高，且部分從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核表達(dá)，激活了經(jīng)典Wnt通路導(dǎo)致了IGC發(fā)生；從CSG到DGC發(fā)展進(jìn)程中，伴隨Shh表達(dá)顯著增多，可能導(dǎo)致Shh信號(hào)通路異常激活與DGC發(fā)病密切相關(guān).雖然Sfrp1是Shh和Wnt兩個(gè)信號(hào)通路相互作用的重要交叉點(diǎn)[23]，但蛋白Shh和β-catenin在IGC及DGC中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Sfrp1表達(dá)水平與無(wú)關(guān).