尹澤超，王玉婷，王耀杰，桑利群，羅秋香，孟凡娟

（1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.西藏自治區(qū)林木科學(xué)研究院，西藏 拉薩 850000；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000）

西藏巨柏Cupressus giganteaW.C.Cheng et L.K.Fu 為柏科Cupressaceae 柏木屬Cupressus植物，主要分布于雅魯藏布江朗縣至米林附近的沿江地段，呈零星分布，是西藏特有的古樹，又稱“雅魯藏布江柏木”，壽命可達千年[1]。同時也是較為典型的西藏“孑遺植物”，已經(jīng)在《國家重點保護野生植物名錄》中被列為國家Ⅰ級保護植物[2]。此外，西藏巨柏一直以來被用于制作藏香，在藏傳佛教的宗教活動中發(fā)揮著重要作用，同時巨柏具有耐干旱、耐瘠薄等特征，針對巨柏這些特點開展研究具有較高文化價值和生態(tài)價值[3-4]。

但是，由于西藏植物生長在獨特的地理環(huán)境條件，針對西藏植物開展的深入研究還較少[5]。因此，本研究利用巨柏為研究材料，對于植物生態(tài)學(xué)和進化生物學(xué)研究具有較高生態(tài)價值和科學(xué)價值。由于生長環(huán)境特殊，有關(guān)西藏巨柏的研究報道還較少，其蛋白組學(xué)方面的研究則更少。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是以蛋白質(zhì)組為研究對象，可以從整體水平研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)[6-7]。但是，由于蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)受植物材料本身因素的影響較大，本試驗中的研究材料巨柏葉片中含有多種次生代謝物質(zhì)以及精油組分，在很大程度上影響了葉片蛋白的提取[3]。因此，本試驗采取3 種葉片總蛋白質(zhì)提取方法，同時進行了一些細(xì)節(jié)的優(yōu)化，以篩選出一種可獲得高質(zhì)量西藏巨柏葉片總蛋白的提取方法，并建立了適合于西藏巨柏葉片蛋白質(zhì)組分析的蛋白雙向電泳技術(shù)體系，從而為從蛋白組水平研究西藏巨柏奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及藥品使用

將西藏巨柏種子播種于蛭石和土（1 ∶3）混合的土壤中，待葉片生長至30 d 左右進行葉片總蛋白的提取。其中主要使用三氯乙酸，丙酮，醋酸銨，蛋白酶抑制劑，Tris 飽和酚和水飽和酚等化學(xué)藥品，且皆為化學(xué)純。

1.2 提取方法

1.2.1 酚抽提法

取3 g 巨柏葉片放入研缽中，加入少量液氮，充分研磨；研磨至細(xì)小粉末狀時，加入Tris 飽和酚和抽提液，用清潔后的藥勺轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中；用漩渦震蕩器充分震蕩，每震蕩1 min 冰上冷卻1 min，直到離心管中的固體粉末變?yōu)橐后w即可；在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心20 min，將上層酚相轉(zhuǎn)移至新離心管中，放置在冰上；向下層水相中加入抽提液和Tris 飽和酚，使用漩渦震蕩器震蕩30 min，每震蕩1 min 冰上冷卻1 min，使蛋白質(zhì)得到充分提??；于4 ℃，10 000 r/min 離心20 min，將酚相轉(zhuǎn)移至新50 mL 離心管中；兩次所得酚相合并，加入酚相5 倍體積的醋酸銨甲醇于酚相中，震蕩30 s，放置在-20 ℃冰箱中沉淀1 h 或者沉淀過夜；于4 ℃，10 000 r/min 離心15 min，棄上清，加入醋酸銨甲醇，將沉淀沿著管壁分散開，充分混勻，-20 ℃沉淀15 min，重復(fù)3 遍；于4℃，10 000 r/min 離心15 min，加入80%丙酮溶液，將沉淀沿著管壁分散開，充分混勻，-20 ℃沉淀15 min；加入100%丙酮溶液，吸打沉淀并充分混勻，-20 ℃沉淀15 min，重復(fù)3 遍；晾干，使沉淀干燥，保存于-80℃后備用。當(dāng)電泳時，加入蛋白樣品10 倍體積的裂解液,室溫裂解1 h；于4℃，13 000 r/min 離心0.5 h，將上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，上清液即為蛋白樣品。

1.2.2 TCA/丙酮法

取3 g 西藏巨柏葉片放入研缽中，加入少量聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及液氮進行充分研磨；研磨至細(xì)小粉末狀后分裝于5 mL 離心管；加入10%TCA 丙酮于離心管中，充分混勻，再放入-20 ℃冰箱中過夜；然后于4 ℃、13 000 r/min 離心20 min；棄去上清液，加入80%丙酮溶液洗滌沉淀；-20℃反應(yīng)20 min，4℃、13 000 r/min 離心20 min；棄去上清液，加入100%丙酮混勻，-20 ℃反應(yīng)20 min。再于4℃、13 000 r/min 離心20 min；用100%丙酮重復(fù)洗滌直到沉淀為白色，最后棄去上清液，使用凍干機凍對沉淀進行干燥后按0.1 克加1 mL 的比例加入水飽和酚，再加入1 μL0.1 mol 的DTT，漩渦震蕩混勻，至于冰上放置1 h，期間不時震蕩；4 ℃，13 000 r/m 離心30 min，吸取上清液，并加入3 倍體積的醋酸銨甲醇和1 μL0.1 mol 的DTT，放置于-20 ℃過夜；重復(fù)加入飽和酚提取蛋白的過程，將最終加入醋酸銨甲醇的試管放置于-20 ℃；之后4 ℃、13 500 r/min 離心5 min,棄去上清液；加80%丙酮并用剪過的槍頭吸打，-20 ℃反應(yīng)20 min；然后于4 ℃、13 500 r/min 離心5 min，棄去上清液；加入100%丙酮，并用剪過的槍頭吸打，-20 ℃反應(yīng)20 min；然后于4 ℃、13 500 r/min 離心5 min，棄去上清液；晾干，使沉淀干燥，將沉淀保存于-80 ℃?zhèn)溆?。電泳?yīng)用蛋白時，方法同上。

1.2.3 TCA/丙酮優(yōu)化法

對TCA/丙酮法進行細(xì)節(jié)優(yōu)化，對具體步驟進行如下調(diào)整：樣品在用TCA 丙酮處理后，增加丙酮的清洗次數(shù)，在清洗過程中，使用剪過的槍頭，清洗直到粗蛋白粉末可以在丙酮清洗液中自然沉降為止；在醋酸銨甲醇清洗蛋白質(zhì)樣品的過程中，增加2 次使用醋酸銨甲醇清洗的步驟，并且適當(dāng)增加用丙酮清洗的次數(shù)，直到蛋白樣品可以在清洗液中自然沉降；同時延長蛋白質(zhì)樣品在空氣中晾干的時間，保證沒有丙酮殘留；在裂解液中添加蛋白酶抑制劑，并且在超聲的環(huán)境下進行裂解；與水化液混合后，于4 ℃，13 000 r/min離心30 min，吸取樣品時注意不要吸出沉淀物。

1.3 蛋白定量及一向電泳

采用2-D Quant Kit 試劑盒進行蛋白定量的分析測定。每個樣品重復(fù)測定3 次，取平均值。分別配置分離膠和濃縮膠，在膠孔中加入蛋白樣品，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度確定上樣體積，不夠30 μL 的加入蛋白Buffer 補足，用SDS 緩沖液覆蓋已經(jīng)上樣的膠孔，注意不要產(chǎn)生氣泡或者把蛋白樣品溢出，補充SDS緩沖液至液面完全覆蓋膠孔，蓋上膠條槽蓋子，連接電泳儀，恒壓80 V 進行3 h。染色等具體方法參考曹原等[6]。用掃描儀進行掃膠，把圖片保存為 TIF 格式。掃描完成后對掃描圖片進行分析。

1.4 等電聚焦

在膠條槽中加入蛋白質(zhì)樣品，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度確定上樣體積，不夠250 μL 的加入水化液補足，將13cm，pH 值為4.0～7.0 的膠條放入膠條槽，注意不要產(chǎn)生氣泡，蓋上膠條槽蓋子，置于一向電泳儀（Ettan IP Gphor Ⅱ），等電聚焦程序見表1。

表1 等點聚焦程序Table1 Equal point focusing procedure

第二向SDS-PAGE 的步驟和染色等具體方法參考曹原等[8]，并加以改良。用掃描儀進行掃膠，把圖片保存為 TIF 格式進行后期比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對蛋白濃度的影響

由表2可以看出：采用TCA/丙酮法提取的蛋白質(zhì)濃度高于采用酚抽提法TCA/丙酮法改良法，對TCA-丙酮法進行細(xì)節(jié)優(yōu)化后蛋白的濃度雖然有些下降，但卻在很大程度上提高了蛋白的純度，可能方法二提取的蛋白含有一些可以影響蛋白的濃度的雜質(zhì)。

表2 不同方法提取的蛋白濃度Table2 Concentrations of proteins extracted by different methods

2.2 不同提取方法對蛋白雙向圖譜的影響

圖1為利用3 種不同提取方法對西藏巨柏葉片總蛋白的一向凝膠電泳掃描圖。從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)：采用酚抽提法提取的蛋白圖譜中，有較多蛋白條帶丟失，同時由于丙酮清洗的次數(shù)較少，也導(dǎo)致了在大于38 kDa 的蛋白條帶清晰度不夠；而使用TCA 丙酮法提取的蛋白，蛋白條帶數(shù)有明顯增加趨勢，但是大于38 kDa 的蛋白條帶不夠清晰的問題依舊存在；針對蛋白條帶不夠清晰的問題，利用TCA/丙酮法并進行了進一步的優(yōu)化，主要通過增加丙酮清洗次數(shù)，利用超聲清除殘留核酸，通過高速離心沉淀大部分雜質(zhì)等方法，從而很大程度上提高了蛋白的純度，在圖譜中也可以看到蛋白條帶表現(xiàn)清晰。

圖1 3 種方法提取蛋白質(zhì)的一向凝膠電泳掃描圖像Fig.1 Continuous gel electrophoresis scanning of proteins by three methods

本試驗采取了3 種提取方法分別提取西藏巨柏葉片的總蛋白，比較了3 種不同提取方法的試驗結(jié)果，同時對雙向電泳圖譜的影響進行了對比分析（見圖2）。通過對比3 張凝膠掃描圖，我們可以發(fā)現(xiàn)：采用酚抽提法提取的雙向電泳圖顯示有較多的小分子蛋白出現(xiàn)遺失，尤其是堿性端丟失現(xiàn)象比較嚴(yán)重，而且由于丙酮清洗次數(shù)較少，圖譜中出現(xiàn)明顯的橫帶條紋（圖2a）。而使用TCA 丙酮法提取的蛋白雙向電泳圖顯示：蛋白點數(shù)量明顯增多，但依舊存在較多橫紋以及豎紋，尤其是凝膠上部的一些連續(xù)的蛋白點分離效果較差（圖2b）。采用TCA/丙酮優(yōu)化法，針對出現(xiàn)較多橫豎條紋的現(xiàn)象有所改善，這主要是由于增加了清洗次數(shù)，并通過超聲清去除了蛋白樣品中的核酸成分，并在上樣前，通過高速離心的方法，將大部分雜質(zhì)沉淀在底部而不吸出，從而很大程度上提高了蛋白樣品純度，因此雙向電泳圖譜中的蛋白點清晰可見，且分布均勻（圖2c）。

3 結(jié)論與討論

高質(zhì)量蛋白質(zhì)的提取是蛋白質(zhì)雙向電泳能否成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為了獲得高質(zhì)量的葉片蛋白質(zhì)，不僅需要在提取過程中減少蛋白樣品的損失，還要保證樣品的純度[8]。因此，為了保證蛋白樣品的濃度和純度，應(yīng)該考慮多種因素，首先，對西藏巨柏葉片進行充分研磨是首要的關(guān)鍵步驟，同時使用優(yōu)質(zhì)的藥品對蛋白進行充分溶解也是必要的環(huán)節(jié)。此外，在蛋白提取過程中，應(yīng)避免使用那些可以對蛋白造成過多降解的藥品（如：β-巰基乙醇、DTT、蛋白酶抑制劑等）[9-10]。

圖2 3 種方法提取蛋白的雙向電泳圖譜Fig.2 Two-dimensional electrophoresis maps of proteins extracted by three methods

由于西藏巨柏葉片中含有大量對蛋白提取造成影響的物質(zhì)，這是導(dǎo)致西藏巨柏葉片高質(zhì)量蛋白質(zhì)困難的直接因素，這一問題如果不能解決，將會對后期蛋白雙向電泳擴增產(chǎn)生較大影響，例如會導(dǎo)致：蛋白點分離效果差；較多橫豎條紋出現(xiàn)；分辨率降低；膠板背景脫色不徹底等問題的出現(xiàn)。因此在本研究中，針對蛋白提取過程中的細(xì)節(jié)問題進行了優(yōu)化，從而在雙向電泳圖譜中蛋白點的數(shù)量以及分辨率方面有了明顯的改善。

通過對比不同方法獲得的蛋白圖譜，可以發(fā)現(xiàn)：與方法3 相比，采用方法一和方法二會導(dǎo)致電泳圖譜出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，且方法一提取的蛋白點有較大的損失，同時蛋白點的分離效果也較差，而且不規(guī)則的形狀嚴(yán)重影響了之后的對比分析。而采用方法3 通過增加提純步驟，所獲得的蛋白質(zhì)濃度較高，凝膠上的蛋白點數(shù)目也有所增加，而且不同蛋白點之間分離較為徹底，同時蛋白點形狀更接近較為規(guī)則的圓形，較利于后期的分析比對。

在對黃瓜根系[7]、光核桃葉片[5]等葉片的蛋白質(zhì)提取條件優(yōu)化的結(jié)果也顯示：TCA-丙酮法提取的蛋白質(zhì)量優(yōu)于酚抽提法。而王新芳等對大豆進行總蛋白雙向電泳條件優(yōu)化的試驗結(jié)果表明，酚抽提法提取的蛋白質(zhì)量要優(yōu)于TCA-丙酮法[6，11]。這些不同方法對不同植物材料的適用性，可能是因為不同植物組織含有的成分不同。因此，要獲得不同植物的優(yōu)質(zhì)蛋白，需要根據(jù)植物自身因素來確定。同時，綜合這些方法也發(fā)現(xiàn)：優(yōu)化一些操作細(xì)節(jié)操作，同時使用一些優(yōu)質(zhì)的藥品對實驗的結(jié)果有很大幫助。本試驗在TCA/丙酮法的基礎(chǔ)上進行了細(xì)節(jié)優(yōu)化處理，可以有效的抑制蛋白酶活性，同時去除糖類、鹽類等雜質(zhì)的干擾，從而獲得了高質(zhì)量的西藏巨柏葉片的總蛋白樣品以及蛋白點清晰的蛋白質(zhì)圖譜，也為后期的對比分析工作奠定了良好的基礎(chǔ)。

本研究只通過3 種方法對巨柏葉片的總蛋白圖譜進行了比較，確定了適合巨柏蛋白的提取方法，并獲取到了高質(zhì)量的巨柏蛋白樣品，為今后針對該物種進化對環(huán)境適應(yīng)機理方面的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

采用TCA/丙酮優(yōu)化法，同時注意操作細(xì)節(jié)，可以獲得高質(zhì)量的西藏巨柏葉片總蛋白樣品，為后續(xù)有關(guān)西藏巨柏的蛋白組質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。