2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的制備及抗菌活性研究

袁曉嫻 樂 琳 姜啟興 劉曉麗 陳琬雯 夏文水 平 原

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122；3. 蘇州豐倍生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215000)

殼寡糖(COS)是一種來源廣泛、無毒、溶解性好、具有抗菌性的多糖[1-2]，將殼寡糖應(yīng)用于食品行業(yè)中，不僅可以抑制微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，還能夠改善食品的質(zhì)量[3-4]，但是殼寡糖的抗菌性較弱[5]，通過化學(xué)改性，將具有強(qiáng)抗菌性的物質(zhì)接入殼寡糖中，可以進(jìn)一步提高其抗菌性。有研究表明，將香葉醇[6]、曲酸[7-8]、富馬酸[4]、富馬酸單甲酯[9-10]等具有抗菌性的物質(zhì)接入殼寡糖(殼聚糖)中，均能有效提高抗菌性。

殼寡糖上有3個(gè)改性位點(diǎn)，分別為C-2位氨基[11-13]、C-3位羥基[14]、C-6羥基[15]。有研究[16]表明，因?yàn)榘被哂幸粚?duì)強(qiáng)親核性的孤對(duì)電子，其反應(yīng)活性較羥基的高；殼寡糖的抗菌性有可能是由于C-2氨基的存在[15]，在酸性條件下，質(zhì)子化的氨基帶有正電荷，會(huì)與微生物細(xì)胞壁上的負(fù)電荷相互作用，從而影響微生物的生長(zhǎng)代謝[2]；另由于C-3羥基存在空間位阻，C-6羥基的反應(yīng)活性較C-3羥基高，因此本試驗(yàn)選定C-6位羥基為改性位點(diǎn),保留其具有抗菌作用的氨基。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是GB 2760—2014允許的一種食品用香料，在水果保鮮中應(yīng)用廣泛，同時(shí)也可作為防腐劑延長(zhǎng)食品保質(zhì)期[17]。但2,4-D的毒性殘留問題限制了其應(yīng)用范圍，對(duì)2,4-D衍生物、類似物進(jìn)行研究和篩選得到具有2,4-D生物活性的物質(zhì)，必將提高其在果蔬保鮮和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍[18]。黃麗[19]以2,4-D為囊芯，以明膠/殼寡糖/葡甘聚糖為壁材制備的復(fù)合微球具有良好的緩釋性能，該復(fù)合微球可望在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等行業(yè)得到應(yīng)用。至今并未有研究涉及將2,4-D接入殼寡糖中并測(cè)定該種新物質(zhì)的理化性質(zhì)。本研究擬將2,4-二氯苯氧乙酸與殼寡糖反應(yīng)，通過傅里葉紅外、紫外可見吸收、1H核磁共振對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，所制備的新型食品添加劑2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)，以期提高殼寡糖的抗菌性，擴(kuò)大殼寡糖在食品中的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

殼寡糖：相對(duì)分子質(zhì)量1.5 kDa，脫乙酰度90%，浙江金科藥業(yè)有限公司；

2,4-二氯苯氧乙酸：97%，阿拉丁試劑有限公司；

甲烷磺酸、氯化亞砜、氨水、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙醇等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

水浴鍋：DK-8AXX型，上海一恒科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

酸度計(jì)：FE20K型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：3K15型，德國(guó)Sigma公司；

傅里葉變換紅外光譜儀: Nicolet NexuS470型，美國(guó)Nicolet Instrument Thermo公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：UV-1000型，上海天美科學(xué)儀器有限公司；

全數(shù)字化核磁共振波譜儀：Brucker AV400 MHz型，德國(guó)布魯克AXS有限公司；

X-射線衍射儀：D8Advanca型，德國(guó)布魯克AXS有限公司；

熱重分析儀：TGA2型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-D型，太倉(cāng)市豪誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

隔水式培養(yǎng)箱：GHP-9080N型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)的合成路線 如圖1所示。具體操作：

圖1 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)的合成路線圖

(1) 殼寡糖氨基的保護(hù)。保護(hù)殼寡糖上反應(yīng)活性較高的氨基，以避免其參與反應(yīng)。常見的殼寡糖氨基的保護(hù)方法有：Schiff堿法[8]、鄰苯二甲酸酐保護(hù)法[20]、對(duì)甲基苯磺酸成鹽法、甲磺酸保護(hù)法[21]等。本試驗(yàn)采用甲磺酸保護(hù)氨基，優(yōu)點(diǎn)是在脫保護(hù)過程中不會(huì)對(duì)酯鍵造成影響。取0.02 mol的殼寡糖，在冰浴條件下溶解在30 mL甲烷磺酸中，反應(yīng)30～60 min，使甲烷磺酸與殼寡糖的氨基形成甲烷磺酸鹽，從而防止氨基參與后續(xù)反應(yīng)。

(2) 2,4-二氯苯氧乙酸的羧基活化，以提高反應(yīng)活性。采用酰氯化的方法來活化羧基[21]。取0.02 mol的2,4-二氯苯氧乙酸于圓底燒瓶中，再加入17 mL的SOCl2，60 ℃反應(yīng)6 h，反應(yīng)過程應(yīng)注意嚴(yán)格控制干燥條件，防止水分進(jìn)入發(fā)生水解，冷卻至室溫后，旋蒸除去未反應(yīng)的SOCl2，得到的透明液體為2,4-二氯苯氧乙酰氯。

(3) 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯磺酸鹽的制備。將殼寡糖甲烷磺酸鹽逐滴加入2,4-二氯苯氧乙酰氯中，室溫下反應(yīng)4 h，-18 ℃貯藏過夜，加入過量丙酮，沉淀，11 000 r/min 離心5 min使固液分離，用丙酮洗滌上清液至無色，乙醇洗滌2次，得到產(chǎn)物2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯磺酸鹽。

(4) 氨基脫保護(hù)。將2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯磺酸鹽溶于一定量的去離子水中，用氨水調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，析出褐色沉淀，11 000 r/min離心5 min使固液分離，將沉淀用丙酮洗滌至上清液無色，乙醇抽提48 h以去除醇溶性雜質(zhì)，真空干燥后得最終產(chǎn)品2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)。

1.2.2 結(jié)構(gòu)表征及性質(zhì)測(cè)定

(1) 傅里葉紅外光譜：殼寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紅外光譜通過傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定，采用溴化鉀壓片法測(cè)定，以溴化鉀為背景，掃描范圍為4 000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1。

(2) 紫外可見吸收光譜：殼寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紫外吸收光譜通過紫外—可見分光光度計(jì)測(cè)定，紫外分光光度計(jì)的狹縫寬度為2 nm。以去離子水為空白，測(cè)定殼寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紫外全波長(zhǎng)光譜。

(3)1H核磁共振圖譜：樣品的1H核磁共振圖譜是由全數(shù)字化核磁共振波譜儀測(cè)定，殼寡糖的測(cè)定條件為：溫度25 ℃，溶劑為重水；2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的測(cè)定條件為：溫度60 ℃，溶劑為氘代DMSO。

(4) X射線衍射：樣品的X射線衍射圖譜的測(cè)定采用X射線衍射儀，掃描條件：X光管為陶瓷型，Cu靶，射線波長(zhǎng)為0.154 nm，光管功率為2.2 kW，X射線發(fā)生器輸出功率300 W，管壓40 kV，電流50 mA，掃描溫度25 ℃，掃描速度2°/min，掃描范圍5°～60°。

(5) 熱穩(wěn)定性：由熱分析儀器測(cè)定。檢測(cè)條件為：N2流速20 mL/min，升溫速率為20 ℃/min，加熱溫度范圍為30～450 ℃。

(6) 抑菌性：菌種活化：挑取單一菌落于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，吸取200 μL一代菌液于新的10 mL LB液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至OD600=0.5。菌液制備：將二代菌液進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)選定稀釋倍數(shù)。抑菌樣品：以去離子水為溶劑，配置濃度為2.0 mg/mL的樣品(殼寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯)溶液。抑菌性測(cè)定：以滅菌后的去離子水為空白，測(cè)定殼寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的抗菌性。吸取1.0 mL的抑菌樣品及100 μL菌液至平板中，倒入40 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，冷卻至凝固后，于隔水式培養(yǎng)箱中，37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察平板中細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

如圖2所示，殼寡糖的紅外光譜中，3 400 cm-1附近的寬峰屬于氨基及羥基；1 618，1 515，1 379 cm-1分別為殼寡糖的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ吸收峰；1 069 cm-1為殼寡糖糖環(huán)骨架氧橋的伸縮振動(dòng)[22-23]。2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紅外光譜中，出現(xiàn)了1 752，1 287，869，803 cm-1等新峰，其中1 752，1 287 cm-1為酯鍵的C═O吸收峰及C—O吸收峰；869，803 cm-1為苯環(huán)在1,2,4位有取代時(shí)的吸收峰；從紅外可以初步判斷目標(biāo)產(chǎn)物的合成。

圖2 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的紅外光譜圖

2.2 紫外可見吸收光譜分析

如圖3所示，紫外光譜主要用于提供分子的芳香結(jié)構(gòu)和共軛體系信息。殼寡糖本身并沒有生色團(tuán)，但殘留乙酰氨基中的C═O會(huì)顯示出吸收峰[24]。在殼寡糖的紫外光譜中，于190，280 nm左右有吸收峰。其中，190 nm 左右的吸收峰為殼寡糖氨基上的電子n→δ*躍遷的紫外吸收峰，而280 nm左右的吸收峰為C═O的R帶吸收峰[25]18-19。在終產(chǎn)物Dcpo-O-COS的紫外吸收中，229 nm處屬于芳香族化合物的B吸收帶的吸收峰，200，283 nm處的吸收峰可歸屬為羰基結(jié)構(gòu)的π→π*和n→δ*躍遷，此結(jié)果與紅外結(jié)果一致，說明2,4-二氯苯氧乙酸成功接入殼寡糖。

圖3 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的紫外—可見吸收光譜

2.3 1H核磁共振圖譜分析

由圖4可知δ=2.07處的吸收峰屬于殼寡糖中未脫盡的乙?；稀狢H3的化學(xué)位移；δ=3.11處的吸收峰屬于氨基葡萄糖殘基上H的化學(xué)位移[26]；δ=3.37～4.05為殼寡糖的特征組峰，屬于殼寡糖糖環(huán)上的氨基葡萄糖H和N-乙酰氨基葡萄糖殘基上H的化學(xué)位移[27]；δ=4.70 處的吸收峰為溶劑峰。在2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的1H核磁圖譜中，δ=2.49處的吸收峰屬于溶劑峰；δ=4.95處的吸收峰屬于與羰基相連的—CH2上氫的吸收峰；δ=6.88～7.62 處屬于苯環(huán)上未被取代H的化學(xué)位移；核磁結(jié)果與紅外結(jié)果一致，表明2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的成功合成。

圖4 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的1H核磁共振圖譜

2.4 X射線衍射圖譜分析

由圖5可知，殼寡糖有2個(gè)主要的衍射吸收峰，在2θ=13°和2θ=22°處，分別歸屬于殼寡糖分子的Ⅰ型和Ⅱ型晶型的特征吸收峰，X-射線衍射強(qiáng)度不大，說明結(jié)晶性能不強(qiáng)[25]21-22。經(jīng)改性后的2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯出峰位置稍向左偏移，且峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說明將2,4-二氯苯氧乙酸引入殼寡糖之后，改變了殼寡糖內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)更加規(guī)整有序，結(jié)晶性能變強(qiáng)[28]。

圖5 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的X-射線衍射圖

2.5 熱穩(wěn)定性

圖6(a)為熱失重率曲線圖(TG)，圖6(b)為熱失重率曲線圖的一階導(dǎo)數(shù)曲線圖(DTG)。由圖6可知，殼寡糖在30～450 ℃時(shí)存在2個(gè)失重階段。一階失重發(fā)生于70～150 ℃，失重率為7.5%，這一階段的失重主要是由于分子中自由水和結(jié)晶水的蒸發(fā)導(dǎo)致；二階失重發(fā)生于170～350 ℃，失重率為53.5%，最快降解速率的溫度Tmax=224 ℃，這一階段的熱失重相對(duì)比較復(fù)雜，包含糖環(huán)類的脫水、解聚和烷基化單元的聚合物的分解等[25]22-23。

圖6 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的熱重分析圖

改性后的2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯在30～450 ℃時(shí)也存在2個(gè)失重階段。其中一階失重在60～132 ℃，失重率為4.4%；二階失重在134～408 ℃，失重率為62.1%，最快降解速率的溫度Tmax=279 ℃。由此可見，2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的熱穩(wěn)定性較殼寡糖有所提高，可能是引入2,4-二氯苯氧乙酸乙酸后，使衍生物較殼寡糖的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象更為規(guī)整有序，從而使得2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的熱穩(wěn)定性提高。此結(jié)果與上述X射線衍射分析結(jié)果一致。

2.6 抑菌性

由表1可知，殼寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出抗菌性，其中2,4-二氯苯氧乙酸>2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯>殼寡糖。2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性較殼寡糖均有所提高，可能是保留了殼寡糖具有抗菌作用的氨基，同時(shí)引入具有強(qiáng)抗菌作用的2,4-二氯苯氧乙酸。通過計(jì)算平均菌落總數(shù)可以得出，相對(duì)于殼寡糖，2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯對(duì)大腸桿菌的抗菌性提高了54.72%，對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性提高了60.98%。

表1 樣品對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用

3 結(jié)論

本試驗(yàn)提供了一種潛在的新型食品抗菌劑——2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的合成路線，經(jīng)過紅外、紫外以及1H NMR對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，證明2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯合成成功，其結(jié)晶性、熱穩(wěn)定性及抗菌性較殼寡糖均有所提高，與對(duì)大腸桿菌抗菌作用相比，對(duì)金黃色葡萄球的抗菌作用提高得更為顯著，2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯有望成為一種新型抗菌劑應(yīng)用于食品行業(yè)中。

本研究中主要就新型物質(zhì)的合成和表征進(jìn)行了研究，但2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯針對(duì)細(xì)菌的抑制機(jī)理還未知，新型物質(zhì)是否能夠應(yīng)用于食品中還需要進(jìn)行相關(guān)的毒理性試驗(yàn)研究。