秀珍菇鮮味菇液酶解制備工藝優(yōu)化

方若思 吳安琰 顧宇婷 陳咨豪 李 堅 項雅麗 楚秉泉 肖功年 劉士旺 龔金炎

(1. 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點試驗室，浙江 杭州 310023；3. 浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023)

食用菌含有豐富的氨基酸等呈味物質(zhì)，鮮味獨特，因此調(diào)味料開發(fā)是其深加工的重要方向。國內(nèi)外采用食用菌提取物提味增鮮，但工藝簡單，食用菌來源單一[1]。秀珍菇脂肪含量較低，蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸種類齊全，其中必需氨基酸含量在35%以上[2-3]，還含有活性多糖、黃酮等成分[4-6]。但關(guān)于酶解法提取秀珍菇有效成分的工藝研究較少，陳雅平等[7]以氨基酸利用率為主要評價指標(biāo)酶解秀珍菇，通過單因素試驗和正交試驗，最佳酶解條件為復(fù)合風(fēng)味酶用量0.5%，酶解時間120 min，酶解溫度50 ℃，pH值8.5，秀珍菇氨基酸利用率為27.9%；李佳佳等[8]以秀珍菇干粉為原料，利用生物酶解和美拉德反應(yīng)技術(shù)制備具有菌菇特征風(fēng)味的調(diào)味核心基料，以還原糖含量和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為指標(biāo)，確定纖維素酶和中性蛋白酶的最佳酶解條件，在此條件下制備的秀珍菇酶解液水解度為13.75%。利用秀珍菇與其他菌類復(fù)配的食用菌調(diào)味菇液的研究則未見報道，國外研究主要集中在秀珍菇的主要功能及相關(guān)生物活性、營養(yǎng)成分的鑒定分離純化及開發(fā)等方面[8-9]；而國內(nèi)研究則主要集中在生物學(xué)特性、褐變保鮮、功能成分提取及活性等方面[10-11]。

海鮮菇是一種藥食兩用的珍稀菌[12-13]，氨基酸含量豐富，含有對人體有益的黃酮和酚類等營養(yǎng)成分，具有抗炎癥、抗氧化等功能[14-16]。香菇營養(yǎng)豐富，含有如多糖、香菇嘌呤、氨基酸等多種有效成分，香菇多糖的抗病毒，抗腫瘤以及調(diào)節(jié)免疫功能突出[17]?；覙浠ㄎ兜栗r美，營養(yǎng)豐富，抗腫瘤多糖、多酚、酮類和甾類的含量可觀，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、平衡營養(yǎng)成分等特殊藥理作用[18-19]。

為均衡營養(yǎng)、提高活性成分含量，協(xié)調(diào)不同食用菌的功能，本試驗擬以秀珍菇為主要原料，輔以海鮮菇、香菇和灰樹花3種食用菌，探索不同配比的食用菌在纖維素酶和蛋白酶復(fù)配的酶解條件下，優(yōu)化制取高氨基酸含量的食用菌調(diào)味菇液的工藝條件，以期為秀珍菇等食用菌綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

秀珍菇、海鮮菇、香菇、灰樹花：縉云縣珍稀食用菌專業(yè)合作社提供；

秀珍菇、海鮮菇、香菇、灰樹花在50～70 ℃下烘干8 h、磨成粉末，裝在封口袋中放置于陰涼干燥處保存。

1.1.2 試劑

抗壞血酸：生物試劑，純度>98%，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；

茚三酮：生物試劑，純度>98%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

醋酸、正丙醇、正丁醇、乙二醇：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；

硫酸：分析純，衢州巨化試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)：TG18K型，長沙東旺實驗儀器有限公司；

高速多功能粉碎機(jī)：RHP-600型，浙江榮浩工貿(mào)有限公司；

凱氏定氮儀：UDK 159型，上海人和科學(xué)儀器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9076 MBE型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

紫外可見分光光度計：UV 5500PC型，上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

各食用菌按比例混合→加水溶解→調(diào)節(jié)pH→纖維素酶酶解4 h→調(diào)節(jié)pH→蛋白酶酶解→滅酶→離心→鮮味菇液

1.3.2 食用菌蛋白質(zhì)含量測定 凱氏定氮法。參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用VELP UDK159自動定氮儀測定。

1.3.3 酶解工藝的優(yōu)化

(1) 食用菌配伍比例：取3.333 g(料液比1∶15 g/mL)不同食用菌配伍比(見表1)食用菌干粉，加入50 mL去離子水充分溶解，調(diào)節(jié)pH至5.0，加入0.04%纖維素酶，搖勻，于50 ℃水浴酶解4 h，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入0.1% 蛋白酶，搖勻，再置于50 ℃水浴酶解5 h。酶解結(jié)束后，水解液在100 ℃下加熱滅酶10 min，7 000 r/min離心15 min，取適量上清液20倍稀釋后備用。

表1 食用菌配伍質(zhì)量比例

(2) 料液比：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，以料液比1∶10，1∶15，1∶20,1∶25 (g/mL)，按1.3.2(1)所示方法，考察料液比對水解度的影響。

(3) 蛋白酶酶解溫度：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，按1.3.2(1)所示方法，加入蛋白酶搖勻后，分別于30，35，40，45，50，55 ℃ 的水浴酶解5 h，考察蛋白酶酶解溫度對水解度的影響。

(4) 蛋白酶酶解時間：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，按1.3.2(1)所示方法，加入蛋白酶搖勻后，分別于50 ℃水浴酶解0.5，1.0，3.0，5.0，7.0 h，考察蛋白酶酶解時間對水解度的影響。

(5) 纖維素酶酶解pH值：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，分別調(diào)節(jié)纖維素酶酶解pH至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，按1.3.2(1)所示方法，考察纖維素酶酶解pH值對水解度的影響。

(6) 蛋白酶酶解pH值：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，加入50 mL去離子水充分溶解，調(diào)節(jié)pH至5.0，加入0.021 3 g 纖維素酶，搖勻，于50 ℃水浴酶解4 h，分別調(diào)解pH至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，加入0.053 3 g蛋白酶，搖勻，于50 ℃水浴酶解5 h。隨后加熱滅酶并離心，取適量上清液20倍稀釋后備用。

(7) 纖維素酶添加量：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，按1.3.2(1)所示方法，分別加入0.02%，0.04%，0.10%，0.20%，0.40% 纖維素酶，考察纖維素酶添加量對水解度的影響。

(8) 蛋白酶添加量：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，按1.3.2(1)所示方法，分別加入0.02%，0.04%，0.10%，0.20%，0.40% 蛋白酶，搖勻，考察蛋白酶添加量對水解度的影響。

1.3.4 測定項目及方法

(1) 游離α-氨基態(tài)氮測定：取待測液1.0 mL，去離子水1mL，水合茚三酮3.0 mL(0.6 g重結(jié)晶的茚三酮用15 mL 正丙醇、30 mL正丁醇、60 mL乙二醇及9 mL pH 4.54的醋酸鹽緩沖液溶解)，0.1%抗壞血酸溶液0.1 mL，混勻，封口。沸水浴加熱15 min后冷卻，加入14.9 mL的60%乙醇溶液，搖勻，于570 nm測定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取5 μg/mL精氨酸氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL至6個25 mL容量瓶中，分別加水補(bǔ)充至2.0 mL，加水合茚三酮3.0 mL，加抗壞血酸溶液0.1 mL(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%)，混勻，封口，在沸水浴中加熱15 min，取出用冷水快速冷卻至室溫，定容，搖勻，靜置15 min，加入14.9 mL的60%乙醇溶液，搖勻，于570 nm波長下，以空白試劑為參比測定各溶液吸光度A，以氨基酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2) 水解度的測定：水解度指游離α-氨基態(tài)氮占總氮的百分比，按式(1)計算：

(1)

式中：

c——水解度，%；

m1——游離α-氨基態(tài)氮質(zhì)量，g；

m2——總氮質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用菌蛋白質(zhì)含量測定

由表2可知：秀珍菇蛋白質(zhì)含量(19.958 g/100 g)最高，其次為灰樹花(蛋白質(zhì)含量約14.128 g/100 g)，再次為海鮮菇(蛋白質(zhì)含量為12.852 g/100 g)，香菇蛋白質(zhì)含量最低(12.719 g/100 g)。因此，選擇以秀珍菇為主要原料，配合香菇、海鮮菇和灰樹花的食用菌干粉為研究對象。

2.2 游離α-氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以精氨酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.037 3x-0.009 3，相關(guān)系數(shù)為R2=0.989 9，結(jié)果如圖1所示。

表2 各菌菇的含氮量及蛋白質(zhì)含量(干基)

圖1 α-氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素最佳酶解條件確定

2.2.1 食用菌配伍比例對水解度的影響 蛋白質(zhì)含量高的菌菇，其組分含量越高，水解度就越大，秀珍菇的蛋白質(zhì)含量最大。由圖2可以看出：隨著秀珍菇組分含量的升高，水解度增大，秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花=6.0∶3.0∶0.5∶0.5時，水解度達(dá)到最大值為16.987%，此時氨基酸占總氮含量的比重最大，說明在該條件下，酶解產(chǎn)生的游離氨基酸含量最高。因此，確定該配比為最佳配比。

圖2 組分比對水解度的影響

2.2.2 料液比對水解度的影響 由圖3可知：當(dāng)料液比為1∶15(g/mL)時，水解度達(dá)到最大值為16.463%，此時氨基酸占總氮含量的比重最大，說明在該條件下，酶解產(chǎn)生的游離氨基酸含量最高。因此，確定該料液比為最佳。

2.2.3 蛋白酶酶解溫度對水解度的影響 蛋白酶酶解溫度是影響蛋白酶活性的重要因素。如圖4所示，在30～40 ℃時水解度隨著溫度的升高而大幅增大，溫度達(dá)到40 ℃ 時樣品蛋白質(zhì)的水解度達(dá)到最大值17.939%，當(dāng)溫度從40 ℃繼續(xù)上升到60 ℃時水解度逐漸下降，酶解溫度對水解度的影響較大。因此，選定40 ℃為蛋白酶酶解的最適溫度，進(jìn)入下一步試驗。

圖3 料液比對水解度的影響

圖4 蛋白酶酶解溫度對水解度的影響

2.2.4 蛋白酶酶解時間對水解度的影響 由圖5可知，酶解0.5～5.0 h時，隨時間的延長，水解度逐漸增大，且在3～5 h時增幅最大，酶解5 h后增幅減緩。故后續(xù)試驗選擇蛋白酶酶解時間為5 h。

2.2.5 纖維素酶酶解pH值對水解度的影響 pH值可影響底物和纖維素酶的穩(wěn)定性。由圖6可知：隨著pH的增大，水解度逐漸增大，當(dāng)pH達(dá)到5.5時水解度達(dá)到最大值17.470%，之后水解度呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。因此，選擇纖維素酶酶解pH為5.5為最佳。

圖5 蛋白酶酶解時間對水解度的影響

圖6 纖維素酶酶解pH值對水解度的影響

2.2.6 蛋白酶酶解pH值對水解度的影響 由圖7可知，隨著pH的增大，水解度逐漸增大，當(dāng)pH達(dá)到7.5時水解度達(dá)到最大值，之后水解度呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。因此，后續(xù)試驗選擇蛋白酶酶解pH為7.5。

圖7 蛋白酶酶解pH值對水解度的影響

2.2.7 纖維素酶添加量對水解度的影響 如圖8所示，當(dāng)?shù)孜锖枯^高時，酶促反應(yīng)速度與酶含量呈正比，纖維素酶添加量在0.02%～0.10%時，水解度大幅增加，而在0.10%～0.40%時水解度有減小的趨勢，原因有兩個：① 當(dāng)酶添加量達(dá)到0.1%以后，水解產(chǎn)生的產(chǎn)物可能對酶活有抑制作用；② 大部分底物已被反應(yīng)消耗。所以最適纖維素酶添加量為0.10%。

圖8 纖維素酶添加量對水解度的影響

2.2.8 蛋白酶添加量對水解度的影響 從圖9可以看出：當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿繌?.02%增加到0.10%時，酶促反應(yīng)速率大大增加，水解度大幅增加。當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿繌?.10% 增加到0.40%時，雖然酶促反應(yīng)速率繼續(xù)增大，但底物物料有限，幾乎被完全水解，所以水解度趨于平穩(wěn)。因此，選擇0.10%為最適蛋白酶添加量。

圖9 蛋白酶添加量對水解度的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化最佳酶解工藝

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對水解度影響較大的蛋白酶酶解溫度、纖維素酶添加量和蛋白酶酶解pH值等3個影響因子，其他因素選取單因素試驗最佳條件，采用三因素三水平的響應(yīng)曲面分析方法進(jìn)行酶解條件的優(yōu)化，其因素水平編碼見表3，試驗因素與水平設(shè)計見表4。軟件分析得到水解度對以上3個因素的二次多項回歸模型為：

DH=-437.710 18+5.471 63A+31.909 13B+93.122 27C+0.959 53AB-0.044 06AC+5.580 96BC-0.062 499A2-505.540 58B2-6.298 88C2。

(2)

2.3.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 由圖9可以看出，隨著纖維素酶量從0.05%增加到0.11%和蛋白酶酶解溫度從35 ℃ 上升到42 ℃的過程中，水解度上升變化明顯；繼續(xù)提高纖維素酶添加量和蛋白酶酶解溫度，水解度開始下降。結(jié)合等高線圖可以得出，等高線中的最小橢圓的中心點即是響應(yīng)面的最高點，等高線形狀呈橢圓形，表示A和B兩因素交互作用較顯著。由圖10可以得出，蛋白酶酶解溫度和蛋白酶pH值曲線坡度大，說明這兩個因素對水解度的影響變化很快。隨著蛋白酶酶解溫度從35 ℃上升到42 ℃和蛋白酶pH值從7.0上升到7.4的過程中，水解度上升變化明顯；繼續(xù)提高蛋白酶酶解溫度，水解度上升變化不明顯；而繼續(xù)提高蛋白酶pH值，水解度急劇下降，表明蛋白酶對pH變化較敏感且其最適宜pH為7.2～7.4。結(jié)合等高線圖可以得出，等高線中的最小橢圓的中心點即是響應(yīng)面的最高點，等高線形狀呈橢圓形，表示A和C兩因素交互作用較顯著。由圖11以發(fā)現(xiàn)，蛋白酶pH值曲線比纖維素酶添加量曲線變化更大，說明蛋白酶pH值對水解度的影響更為顯著。隨著纖維素酶添加量從0.05% 上升到0.11%和蛋白酶pH值從7.0上升到7.4的過程中，水解度平穩(wěn)上升；繼續(xù)提高纖維素酶添加量和蛋白酶pH值，水解度呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)合等高線圖可以發(fā)現(xiàn)，等高線圖形呈明顯的橢圓形，表明B和C兩因素交互作用顯著。

表3 因素水平編碼表

表4纖維素酶和蛋白酶酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化方案與結(jié)果

Table4Responsesurfaceoptimizationschemeandresultsofcellulaseandneutralproteasehydrolysisconditions

組別ABCDH/%100018.416200017.802300018.357410-117.6825-1-1014.382601114.745710115.3918-11014.56890-1-116.262100-1112.9231101-117.5251211016.85013-10112.6691400018.5341500017.90216-10-114.519171-1015.704

表5 響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果?

圖10 蛋白酶酶解溫度和纖維素酶添加量對水解度的影響

圖11 蛋白酶酶解溫度和酶解pH值對水解度的影響

圖12 纖維素酶添加量和蛋白酶酶解pH值對水解度的影響

結(jié)合P值可知：模型的一次項A和C極顯著，二次項A2和C2極顯著，B2顯著表明各因素對水解度的影響不是簡單的線性關(guān)系。該模型下得到最佳工藝參數(shù)為蛋白酶酶解溫度42.06 ℃、蛋白酶pH 7.29、纖維素酶添加量0.11%，此時水解度為18.775%。結(jié)合實際，調(diào)整各因素為蛋白酶酶解溫度42 ℃、蛋白酶pH 7.30、纖維素酶添加量0.10%，此時水解度為18.510%，與預(yù)測值相差為1.41%，證明了該模型的可靠性。

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，制取高氨基酸含量的最優(yōu)酶解工藝條件為蛋白酶酶解溫度42 ℃、蛋白酶pH 7.30、纖維素酶添加量0.10%，此時水解度為18.510%。

多種食用菌復(fù)配結(jié)合制備鮮菇菌液的方式，不僅有利于協(xié)調(diào)不同食用菌的氨基酸，同時可以增加產(chǎn)品的功能性，為開發(fā)秀珍菇等食用菌深加工產(chǎn)品提供新思路，但是本研究還存在一些不足，雖然水解度比單一采用秀珍菇水解度高[19]，但仍有提高空間，這可能與所選取的食用菌種類有關(guān)，后續(xù)可以本研究作為基礎(chǔ)，開發(fā)更多秀珍菇及其他菌類復(fù)合的深加工產(chǎn)品，提高氨基酸利用率，增進(jìn)營養(yǎng)和保健功能。同時，進(jìn)行單一菌菇酶解制備菇液，得到鮮味液體在氣味上尚有不足；如果通過添加部分還原糖，進(jìn)行美拉德反應(yīng)，就能夠滿足氣味上的要求。