王蕊

【摘要】目的： 探討新型精胺氧化酶（spermine oxidase，SMO）小分子抑制劑SI-4650對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的影響。方法：采用MMT法對(duì)U87MG細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行分析，對(duì)U87MG細(xì)胞的自噬作用采用激光共聚焦顯微鏡（LSCM）進(jìn)行分析。結(jié)果： 采用SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞進(jìn)行處理2.4、48、72h后，實(shí)施MTT法進(jìn)行分析表明，SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞增殖具有抑制作用。經(jīng)處理后，采用LSCM對(duì)U87MG細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，觀察到未經(jīng)SI-4650處理的U87MG細(xì)胞中GEP-LC3分布均勻，而經(jīng)SI-4650處理的U87MG細(xì)胞中GEP-LC3呈點(diǎn)狀聚集。結(jié)論： SI-4650能夠抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】SMO抑制劑;神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞;細(xì)胞增殖;自噬

【中圖分類號(hào)】R174+.6

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】2095-6851（2019）10-251-01

天然多胺（poly amine，PA）主要包含腐胺（Put）、精脒（Spd）等，為一種在真核細(xì)胞中廣泛存在且攜帶正電荷的小分子有機(jī)物[1]，可借助靜電作用與細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)等攜帶負(fù)電荷的大分子物質(zhì)相作用，在細(xì)胞的增殖、分化等重要的生理過(guò)程中具有重要的作用[2～3]。有研究表明，若細(xì)胞內(nèi)的多胺含量增加，能夠促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但降低細(xì)胞中的多胺含量則能夠有效避免腫瘤細(xì)胞的增殖，現(xiàn)階段隨著研究的不斷加深，多胺代謝途徑已逐漸成為腫瘤防治的熱點(diǎn)[4]。為明確SI-4650對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的增殖、自噬過(guò)程的影響作用，本研究對(duì)SI-4650進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞（購(gòu)于武漢中國(guó)培養(yǎng)典藏中心）。

1.2 試劑

SI-4650（購(gòu)于荷蘭Specs生物特殊化合物公司）;二甲基亞砜、DMEM、BCA定量盒等均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;血清、抗生素等購(gòu)自于天津?yàn)笊铩?/p>

1.3 儀器

細(xì)胞超凈臺(tái)、恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫冰箱、低溫離心機(jī)、高效液相色譜分析儀、流式細(xì)胞儀等。

2 方法

2.1 SI-4650配置

精確稱量SI-4650粉劑并于DMSO中溶解，濃度為100mmol/L的儲(chǔ)存液，置于-20℃冰箱中保存;在使用前，使用DMEM培養(yǎng)基將上述液體稀釋至適宜濃度。

2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

將濃度為5×106/L的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，采用不同濃度的SI-4650培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)濃度藥物設(shè)置4個(gè)復(fù)孔;繼續(xù)培養(yǎng)2.4、48、72h后，在每孔中加入MTT試劑200μL，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，隨后棄去MTT試劑，加入150μL的DMSO，并使用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A）。

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞自噬小體形成

將5×107/L的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞懸液接種到專用的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞的融合度約為80%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明書，對(duì)U87MG細(xì)胞進(jìn)行處理2.4h后，采用不同濃度的SI-4650培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，隨后采用LSCM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬小體。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 200統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，以（x±s）表示;當(dāng)P<005時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

31 SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞增殖的抑制作用

采用SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞進(jìn)行處理2.4、48、72h后，實(shí)施MTT法進(jìn)行分析表明，SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞增殖具有抑制作用。結(jié)果見圖1。

32 SI-4650誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞自噬

經(jīng)處理后，采用LSCM對(duì)U87MG細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，觀察到未經(jīng)SI-4650處理的U87MG細(xì)胞中GEP-LC3分布均勻，而經(jīng)SI-4650處理的U87MG細(xì)胞中GEP-LC3呈點(diǎn)狀聚集。則說(shuō)明SI-4650可誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞的自噬作用，促進(jìn)GEP-LC3融合蛋白向自噬小體聚集。

4 討論

SMO為促進(jìn)多胺類物質(zhì)分解的關(guān)鍵作用酶之一，其在細(xì)胞內(nèi)的合成水平能夠引起多胺多謝紊亂以及包含腫瘤等多種疾病的發(fā)生[5]。因此，隨著研究的加深SMO成為腫瘤防治的關(guān)鍵性靶點(diǎn)之一。本研究結(jié)果表明，采用SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞進(jìn)行處理2.4、48、72h后，實(shí)施MTT法進(jìn)行分析表明，SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞增殖具有抑制作用。經(jīng)處理后，采用LSCM對(duì)U87MG細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，觀察到未經(jīng)SI-4650處理的U87MG細(xì)胞中GEP-LC3分布均勻，而經(jīng)SI-4650處理的U87MG細(xì)胞中GEP-LC3呈點(diǎn)狀聚集。

綜上所述，SI-4650能夠抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉春霞，黃璐璐，閆辰，等. GLI1抑制劑FL18對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的抑制作用及其機(jī)制[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2018，53（07）：1.11.3-1.1.2.1

[2] 周游，曹春雨，王艷林. 基于多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的靶向抗腫瘤藥物研究進(jìn)展[J]. 生命的化學(xué)，2018，38（04）：543-550

[3] 李建明，丁勁松. 基于多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的抗腫瘤藥物研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2017，33（05）：34-39

[4] 易星，莫遠(yuǎn)亮，姜冬梅，等. 多胺的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26（02）：348-352

[5] 劉英杰，王玉霞，李騫，等. 一種萘酰亞胺-多胺綴合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的殺傷作用[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2016，51（03）：207-2.1.2