王金晶，李夢(mèng)琦，侯丹，許維娜，鄭飛云，劉春鳳，鈕成拓，李崎

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Lager啤酒酵母基因調(diào)控對(duì)其抗自溶性能的影響

王金晶1,2，李夢(mèng)琦1,2，侯丹1,2，許維娜1,2，鄭飛云1,2，劉春鳳1,2，鈕成拓1,2，李崎1,2

1 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無(wú)錫 214122

啤酒酵母的自溶會(huì)嚴(yán)重影響啤酒的品質(zhì)，而酵母的質(zhì)量也被認(rèn)為是啤酒釀造的關(guān)鍵因素之一。前期在啤酒酵母自溶的研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞完整性途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子基因與酵母自溶有密切關(guān)系。本研究在啤酒酵母單倍體菌株中對(duì)進(jìn)行敲除與過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲除后，酵母菌抗自溶性能差，而過(guò)表達(dá)則有助于酵母的抗自溶。另外，發(fā)現(xiàn)基因的敲除影響了酵母的抗?jié)B透壓性能、細(xì)胞壁損傷的耐受性、抗氮饑餓性能和溫度耐受性。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁組裝及DNA損傷應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)隨的過(guò)表達(dá)與敲除而調(diào)整，而CWI途徑中其他相關(guān)基因的調(diào)控方式并沒(méi)有明顯的規(guī)律，推測(cè)可能主要影響了CWI途徑中基因的表達(dá)，進(jìn)而提高啤酒酵母在惡劣環(huán)境中的抗逆性。此研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步選育抗自溶啤酒酵母以及了解啤酒酵母的自溶機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

lager啤酒酵母，抗自溶性能，，細(xì)胞壁完整性

環(huán)境脅迫一直是發(fā)酵工業(yè)中最普遍且不容忽視的問(wèn)題之一。酵母是飲料工業(yè)中常用的菌種之一，也被認(rèn)為是啤酒釀造的關(guān)鍵因素之一。啤酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母細(xì)胞在多次脅迫下會(huì)發(fā)生自降解，這種自降解過(guò)程通常發(fā)生在啤酒的后酵期，對(duì)啤酒的品質(zhì)有顯著影響[1]。啤酒釀造過(guò)程中如有超過(guò)5%的酵母細(xì)胞自溶就會(huì)對(duì)啤酒風(fēng)味、泡沫穩(wěn)定性、膠體穩(wěn)定性造成影響并可能帶來(lái)微生物污染的危害[2]。

啤酒發(fā)酵后期發(fā)生的酵母自溶主要是由營(yíng)養(yǎng)缺乏、應(yīng)激反應(yīng)以及酒精壓力引起的。細(xì)胞壁是細(xì)胞的第一道防線，對(duì)環(huán)境中的不利因素作出反應(yīng)。細(xì)胞壁完整性 (Cell wall integrity，CWI)、細(xì)胞壁的組織和生物合成主要由該通路負(fù)責(zé)[2-3]。以CWI通路激活為主導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄重編程將細(xì)胞從各種應(yīng)激條件下解救出來(lái)。酵母細(xì)胞壁上存在壓力傳感因子，包括Mtl1、Mid2、Wsc1、Wsc2以及Wsc3，當(dāng)這些因子感受到壓力時(shí)，觸發(fā)了絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK) 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)而形成不同的應(yīng)激反應(yīng)來(lái)維持酵母細(xì)胞的生存[3-4]。在CWI通路下游，Slt2磷酸化后激活包括Swi4/Swi6和Rlm1[5]在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子。據(jù)報(bào)道，Slt2和Rlm1是密切相關(guān)的，在細(xì)胞壁受到損傷時(shí)，Rlm1傳導(dǎo)了大多數(shù)依賴于Slt2的轉(zhuǎn)錄激活作用，同時(shí)，CWI途徑與其他信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子之間存在的連接也必須通過(guò)Rlm1依賴的通路進(jìn)行調(diào)控[6]。此外，最近的研究顯示，基因參與了乙酰轉(zhuǎn)移酶 (Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase，SAGA) 復(fù)合物對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，敲除將導(dǎo)致CWI通路失活[4]。

自溶過(guò)程中，啤酒酵母細(xì)胞逐漸喪失生存能力，許多與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因受到調(diào)控，以適應(yīng)環(huán)境的變化。酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和形態(tài)將逐漸改變以應(yīng)對(duì)環(huán)境中的脅迫壓力[1,7]。前期研究發(fā)現(xiàn)在酵母自溶過(guò)程中，CWI途徑中的壓力傳感因子編碼基因包括和表達(dá)水平下調(diào)，而CWI途徑中和表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)[8]。同時(shí)，具有較強(qiáng)抗自溶能力的酵母細(xì)胞表現(xiàn)出剛性的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的抗應(yīng)激能力[9]。雖然轉(zhuǎn)錄因子Rlm1在CWI通路中的作用在釀酒酵母中已有相關(guān)的報(bào)道，但是其在啤酒酵母抗自溶方面的研究尚少，同時(shí)，啤酒酵母由于其遺傳背景的復(fù)雜性表現(xiàn)出與釀酒酵母不同的發(fā)酵及生理特性[10-11]。因此，本研究對(duì)lager型啤酒酵母菌中的進(jìn)行調(diào)控，研究其對(duì)啤酒酵母抗自溶能力的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

菌株H5為本研究室保藏的啤酒酵母單倍體菌株；克隆擴(kuò)增質(zhì)粒pMD19-T simple及大腸桿菌宿主菌JM109均購(gòu)于TaKaRa公司；質(zhì)粒pUG6為本研究室保藏[12]。

LB培養(yǎng)基 (1 L)：10 g蛋白胨，5 g酵母抽提物，10 g NaCl，pH 7.4，固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min[12]。含有氨芐青霉素的抗性培養(yǎng)基終濃度為100 μg/mL。

YPD培養(yǎng)基 (1 L)：10 g酵母抽提物，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖，pH 6.0，115 ℃滅菌15 min。含有G418的抗性培養(yǎng)基終濃度分別為200 μg/mL、300 μg/mL和400 μg/mL。含有NaCl的抗性培養(yǎng)基的濃度為1 mol/L。米卡芬凈抗性培養(yǎng)基終濃度為30 ng/mL。Calcofluor white抗性培養(yǎng)基終濃度為10 μg/mL。

YNB-N培養(yǎng)基 (1 L)：1.7 g無(wú)氨基酸無(wú)硫酸銨酵母氮源，20 g葡萄糖，固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂粉，115 ℃滅菌15 min[12]。

1.1.2 試劑

質(zhì)粒抽提試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、限制性內(nèi)切酶及連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；YNB合成培養(yǎng)基、蛋白抽提試劑盒、溶菌酶購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；Fluorescentbrightener 28 (Calcofluor white) 購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；米卡芬凈購(gòu)自上海灝云藥業(yè)。

1.2 主要方法

1.2.1基因的敲除與過(guò)表達(dá)

根據(jù)釀酒酵母的序列設(shè)計(jì)引物RLM1-F/RLM1-R擴(kuò)增啤酒酵母基因，測(cè)序后以所測(cè)的序列設(shè)計(jì)中斷引物RLM1-LF/RLM1-LR。各引物如表1所示。以pUG6質(zhì)粒為模板，RLM1-LF/RLM1-LR為引物用短側(cè)翼序列PCR介導(dǎo)的一步法 (SFH-PCR)擴(kuò)增帶有上下游同源臂的基因，DNA片段經(jīng)純化后進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建成功后被用于轉(zhuǎn)化啤酒酵母單倍體菌株H5，轉(zhuǎn)化子涂布于新鮮的YPD平板，24 h后影印至含有200 μg/mL的G418抗性平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，獲得敲除菌株。

表1 構(gòu)建菌株所用引物

以基因組DNA為模板，以通用引物EF3、EF4擴(kuò)增啤酒酵母18S rDNA序列，測(cè)序后設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其上下游各200 bp左右的片段作為同源臂。通過(guò)PCR獲得啟動(dòng)子與目的基因，同時(shí)以pUG6為模板，PCR獲得抗性基因，表1為基因擴(kuò)增所用引物及相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。將上述片段以TA克隆的方式連接至pMD19-T simple質(zhì)粒上，經(jīng)Ⅰ和Ⅰ雙酶切后線性轉(zhuǎn)化至H5。在G418抗性平板上挑選陽(yáng)性菌落并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，獲得過(guò)表達(dá)菌株。根據(jù)G418抗性的強(qiáng)弱篩選高拷貝數(shù)的過(guò)表達(dá)菌株[12]。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種至10 mL YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，3 000 ×離心5 min，收集菌體并在無(wú)菌生理鹽水中重懸，調(diào)節(jié)菌體濃度至600=1.0，梯度稀釋后點(diǎn)滴至G418濃度為200 μg/mL、300 μg/mL及400 μg/mL的抗性平板上[12]。28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況，最終篩選獲得含有高拷貝數(shù)的過(guò)表達(dá)菌株。

1.2.2 Rlm1蛋白的SDS-PAGE分離及質(zhì)譜鑒定

將出發(fā)菌株H5和過(guò)表達(dá)菌株在5 mL YPD培養(yǎng)基中28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，后將菌液全部轉(zhuǎn)接至50 mL YPD培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)3–5 h，至菌液濃度為600=1.0–1.5，3 000×離心5 min，棄上清收集菌體，用PBS緩沖液清洗 3次，再用Tris-HCl緩沖液重懸菌體，加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物，超聲破碎提取蛋白質(zhì)[12-13]。Rlm1是核蛋白，因此本研究采用細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒同時(shí)抽提細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，沸水浴5 min后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。將目的條帶切下并進(jìn)行MALDI-TOF-TOF/MS分析，鑒定其是否為目的蛋白R(shí)lm1[12]。

1.2.3 抗自溶指數(shù)測(cè)定

參考前期研究的酵母抗自溶指數(shù)檢測(cè)方法，抗自溶指數(shù)為 (260/280)/死亡率，跟蹤測(cè)定出發(fā)菌H5、基因敲除菌株及過(guò)表達(dá)菌株的260、280和死亡率，計(jì)算獲得抗自溶指數(shù)來(lái)表征各菌株的抗自溶性能[14]。

1.2.4 脅迫耐受性分析

將H5、基因敲除菌株和過(guò)表達(dá)菌株培養(yǎng)12 h后離心收集菌體，重懸于無(wú)菌水中，分別取樣點(diǎn)滴至NaCl抗性平板、熒光增白劑抗性平板和米卡芬凈抗性平板，同時(shí)1 000倍稀釋后涂布于YNB-N平板，分析其對(duì)滲透壓、細(xì)胞壁損傷和氮饑餓的抗性；再將菌液點(diǎn)樣于YPD平板，在22 ℃、28 ℃、37 ℃和42 ℃培養(yǎng)，檢測(cè)其對(duì)溫度的耐受性。

1.2.5 啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

取一環(huán)保藏的斜面菌轉(zhuǎn)接至 10 mL 12°P麥汁試管中，于 28 ℃下活化24 h，后以1%的接種量轉(zhuǎn)接至含有70 mL 12°P麥汁的三角瓶中于25 ℃培養(yǎng)48 h，按2×107CFU/mL酵母細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)接至含2 L 12°P麥汁的3 L帶發(fā)酵栓的錐形瓶中，11 ℃發(fā)酵5 d。主酵結(jié)束后收集發(fā)酵液及酵母細(xì)胞進(jìn)行理化指標(biāo)分析。

1.2.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

發(fā)酵結(jié)束后，收集酵母細(xì)胞，使用5%戊二醛 (0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH 7.2) 進(jìn)行前固定，之后使用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗酵母細(xì)胞，用1%鋨酸 (0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH 7.2) 進(jìn)行后固定，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗，乙醇梯度脫水，樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥后轉(zhuǎn)載至樣品臺(tái)上，離子濺射儀鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)[13]，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后進(jìn)行超薄切片，置于透射電子顯微鏡下觀察[13-14]。

1.2.7 qRT-PCR分析

收集酵母細(xì)胞重懸于無(wú)菌水中，用試劑盒提取總RNA并按TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA保存待用。使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex試劑盒和Roche Light Cycler 480 Ⅱ PCR擴(kuò)增儀 (Roche Diagnostics) 對(duì)CWI途徑中關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)[13]，條件如下： 95 ℃預(yù)變性30 s；變性95 ℃ 5 s，退火/延伸55 ℃ 20 s，循環(huán)40次；95 ℃ 10 s，65 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s。每個(gè)樣品3個(gè)平行，取平均值作為計(jì)算的基礎(chǔ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RLM1基因的敲除及過(guò)表達(dá)

用引物RLM1-F/RLM1-R以啤酒酵母單倍體菌株H5的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因。產(chǎn)物純化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，啤酒酵母H5的序列長(zhǎng)度為2 043 bp[14]，與NCBI公布的釀酒酵母S288c的相似性達(dá)到98%。根據(jù)H5的基因序列設(shè)計(jì)中斷引物RLM1-LF/RLM1-LR，同時(shí)以pUG6質(zhì)粒為模板擴(kuò)增，構(gòu)建基因中斷盒[12]，總長(zhǎng)度為1 704 bp。片段線性化后轉(zhuǎn)化啤酒酵母單倍體菌株H5，在含有200 μg/mL G418的YPD平板上篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖1A所示。出發(fā)菌H5應(yīng)獲得大小為2 043 bp的片段，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子應(yīng)獲得1 704 bp的片段，結(jié)果與預(yù)期相符，最終得到基因敲除菌命名為HΔ。

將18S rDNA上游同源臂、啟動(dòng)子目的基因抗性基因18S rDNA下游同源臂依次連接至pMD19-T simple上，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體。獲得的質(zhì)粒經(jīng)Ⅰ和Ⅰ雙酶切后轉(zhuǎn)化至啤酒酵母單倍體菌株H5，與H5基因組中18S rDNA發(fā)生同源重組，替換原有片段，采用影印法篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，目的基因拷貝數(shù)的高低以重組菌G418抗性的強(qiáng)弱來(lái)表征。即G418抗性強(qiáng)的重組菌，其拷貝數(shù)高，對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)也高[12,15]。過(guò)表達(dá)所獲得的陽(yáng)性重組菌影印至濃度為200、300、400 μg/mL的G418抗性平板上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌最高能耐受400 μg/mL G418，28 ℃培養(yǎng)48 h后，在含有400 μg/mL G418的抗性平板上挑選生長(zhǎng)情況較好的菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，分別以Up-1-F和Up-1-R、Up-2-F和Up-2-R、Down-1-F和Down-1-R作為引物，以H5為對(duì)照。目標(biāo)片段大小應(yīng)為 964 bp、944 bp及856 bp，結(jié)果 (圖1A) 與預(yù)期相符。同時(shí)，提取篩選獲得的過(guò)表達(dá)菌株的細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn)，結(jié)果如圖1B所示。目的條帶被切下后進(jìn)行MALDI- TOF-TOF/MS分析，其中得分最高的蛋白質(zhì)為Rlm1 (登錄號(hào)gi|6325168)，說(shuō)明基因在重組菌中得到了過(guò)表達(dá)[12]，將獲得的過(guò)表達(dá)菌株命名為H/。

圖1 重組菌H-rlm1Δ及H/rlm1的構(gòu)建及驗(yàn)證

2.2 RLM1基因調(diào)控對(duì)菌株抗自溶性能的影響

啤酒酵母對(duì)于啤酒的釀造至關(guān)重要，啤酒優(yōu)良的風(fēng)味主要是由其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，而啤酒酵母在發(fā)酵后期發(fā)生的自溶會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏和溶出，這是啤酒中雜異味的主要來(lái)源。在有些情況下，例如在貯酒期間環(huán)境壓力大、代謝產(chǎn)物積累和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)枯竭等，啤酒酵母在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生大量的自溶，對(duì)啤酒的質(zhì)量造成劇烈的影響。具有較好抗自溶能力的啤酒酵母將對(duì)啤酒的風(fēng)味有積極的貢獻(xiàn)。

將H-Δ、H/與H5培養(yǎng)至穩(wěn)定期后期，收集酵母泥，用檸檬酸緩沖液洗滌2–3遍，每100 mL緩沖液中加入1 g酵母泥，30℃下進(jìn)行模擬自溶，跟蹤260、280和死亡率的數(shù)值[12]，計(jì)算抗自溶指數(shù)，各酵母的抗自溶能力以抗自溶指數(shù)來(lái)表征[14]。圖2為3株菌的抗自溶指數(shù)和死亡率的比較結(jié)果。敲除菌H-Δ死亡速度最快，抗自溶指數(shù)數(shù)值相對(duì)最低，表明其自溶程度高，抗自溶性能差。開始時(shí)，H/死亡速度快于H5，但隨后逐漸減慢，可發(fā)現(xiàn)其抗自溶指數(shù)高于H5，表明其抗自溶性能較好。

前期研究中發(fā)現(xiàn)在不同酵母及不同自溶態(tài)下的轉(zhuǎn)錄水平各異，抗自溶性能好的酵母中的轉(zhuǎn)錄水平較高，而抗自溶性能差的酵母中的轉(zhuǎn)錄水平較低[8,12]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步印證了前期研究的結(jié)果，同時(shí)可以推斷的敲除影響了啤酒酵母的抗自溶能力，而高表達(dá)量的可以減緩自溶的進(jìn)程。

2.3 RLM1基因調(diào)控對(duì)菌株脅迫耐受性的影響

2.3.1 滲透壓及細(xì)胞壁損傷耐受性分析

在含有1 mol/L NaCl的YPD平板上對(duì)H5、HΔ和H/進(jìn)行點(diǎn)樣分析，于28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察其生長(zhǎng)情況，檢測(cè)各菌株對(duì)滲透壓的耐受性，結(jié)果如圖3所示。H/對(duì)滲透壓的抗性稍強(qiáng)于出發(fā)菌H5，而HΔ對(duì)滲透壓的抗性明顯弱于出發(fā)菌H5[12]。

圖3 重組菌與原始菌對(duì)滲透壓及細(xì)胞壁損傷耐受性分析

米卡芬凈 (Micafungin) 能夠非競(jìng)爭(zhēng)性抑制酵母細(xì)胞壁必需成分β-1,3-葡聚糖的合成，是葡聚糖合成酶的抑制劑[9]，可導(dǎo)致細(xì)胞壁合成的缺陷。熒光增白劑 (Calcofluor white) 能夠與細(xì)胞壁組分幾丁質(zhì)結(jié)合，細(xì)胞壁有破損的細(xì)胞會(huì)對(duì)熒光增白劑敏感[17]。米卡芬凈和熒光增白劑均能造成細(xì)胞壁壓力，進(jìn)而引起細(xì)胞壁的損傷。將H5、HΔ和H/分別點(diǎn)滴至含有30 ng/mL米卡芬凈和含有10 μg/mL熒光增白劑的抗性平板上[12]，在28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察其生長(zhǎng)情況，評(píng)價(jià)各菌株對(duì)細(xì)胞壁損傷的耐受性情況。結(jié)果如圖3所示，HΔ對(duì)米卡芬凈和熒光增白劑均比較敏感，特別在熒光增白劑平板上，其生長(zhǎng)被強(qiáng)烈抑制。H/對(duì)米卡芬凈的抗性與H5類似，但H/對(duì)熒光增白劑的抗性略強(qiáng)于H5。結(jié)果表明的缺失嚴(yán)重影響了細(xì)胞對(duì)幾丁質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞損傷的抗性。

2.3.2 溫度耐受性分析

在YPD平板上進(jìn)行H5、HΔ和H/進(jìn)行點(diǎn)樣，分別放置于22 ℃、28 ℃、37 ℃和42 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，檢驗(yàn)其對(duì)溫度的耐受性情況。三株菌在42 ℃均不能生長(zhǎng) (結(jié)果未展示)，如圖4所示HΔ在低溫 (22 ℃) 和高溫 (37 ℃) 下的生長(zhǎng)能力與H5相比略有下降，H/的生長(zhǎng)狀態(tài)與H5相當(dāng)，說(shuō)明敲除后菌株對(duì)溫度的耐受性受到一定的影響。另外，lager型啤酒發(fā)酵溫度一般在11 ℃左右，因此考察了3株菌在11 ℃條件下的生長(zhǎng)能力，在低溫脅迫的情況下，H-Δ生長(zhǎng)能力稍差一些，但沒(méi)有明顯的區(qū)別。

2.3.3 氮饑餓耐受性分析

將H5、HΔ和H/菌液稀釋后涂布于YNB-N平板，28 ℃培養(yǎng)48 h，檢測(cè)各菌株對(duì)氮饑餓的耐受性情況。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為H5菌落數(shù)為70±5，HΔ菌落數(shù)為21±4，H菌落數(shù)為92±7。從饑餓抗性來(lái)看，H/強(qiáng)于H5，而H-Δ明顯弱于H5，結(jié)果表明表達(dá)對(duì)菌株的氮饑餓耐受性起到了增強(qiáng)作用。

2.4 RLM1基因調(diào)控對(duì)菌株發(fā)酵性能及抗自溶性能的影響

將重組菌與原始菌用于啤酒發(fā)酵試驗(yàn)，在主發(fā)酵結(jié)束時(shí)，測(cè)定了發(fā)酵液的幾個(gè)主要參數(shù)，以評(píng)價(jià)不同菌株的發(fā)酵能力。如表2所示，從發(fā)酵度和真實(shí)濃度來(lái)看，不同菌株的發(fā)酵能力相當(dāng)，主要風(fēng)味化合物包括雙乙酰、乙醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊醇、異丁醇和雙硫醚 (DMS) 含量也沒(méi)有太大的差別，在正常發(fā)酵過(guò)程中，健康的酵母不會(huì)發(fā)生自溶，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶也不會(huì)水解自身物質(zhì)，主酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果表明基因調(diào)控對(duì)啤酒酵母的發(fā)酵能力及啤酒的主體風(fēng)味沒(méi)有直接的影響。

圖4 重組菌與原始菌對(duì)溫度耐受性的比較

表2 啤酒發(fā)酵液指標(biāo)分析

為了解釋不同菌株抗自溶能力的差異，收集發(fā)酵后細(xì)胞進(jìn)行了掃描電鏡 (SEM) 及透射電鏡 (TEM) 分析。如圖5所示，與H5相比，H/細(xì)胞體積略變小，呈橢圓形，H-Δ細(xì)胞體積略大，且在發(fā)酵后更容易表現(xiàn)出皺縮及內(nèi)凹的形態(tài)。與原始菌株比較，的敲除可能影響酵母細(xì)胞的大小及在發(fā)酵過(guò)程中的耐受性。但是，比較不同菌株的生長(zhǎng)曲線，3個(gè)菌株之間沒(méi)有顯著的差異。因此，推測(cè)基因修飾導(dǎo)致了啤酒酵母的形態(tài)改變。同時(shí)，啤酒發(fā)酵結(jié)束后收集3株菌進(jìn)行透射電鏡分析，結(jié)果與SEM結(jié)果吻合。H5細(xì)胞核區(qū)完整，胞質(zhì)液泡大 (圖6A)。在H/細(xì)胞發(fā)現(xiàn)液泡變小且分散 (圖6B–C)，H-Δ細(xì)胞中則發(fā)現(xiàn)了逐漸的染色質(zhì)凝聚和核區(qū)的分散 (圖6D–E)?；蚯贸木曛忻黠@出現(xiàn)了細(xì)胞損傷和衰老的現(xiàn)象。

Rlm1是CWI途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)其編碼基因的調(diào)控可能直接影響細(xì)胞完整性途徑中其他基因的表達(dá)。分析了發(fā)酵開始與結(jié)束時(shí)與CWI通路和細(xì)胞壁構(gòu)建相關(guān)的基因 (包括、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、)[17-18]的相對(duì)mRNA水平，其中許多基因在調(diào)節(jié)啤酒酵母的自溶過(guò)程中起著重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H/中與CWI途徑相關(guān)的基因在啤酒發(fā)酵結(jié)束時(shí)大部分發(fā)生上調(diào) (圖7)，上調(diào)最多的基因?yàn)?，該基因涉及?xì)胞壁組裝[19]和DNA損傷應(yīng)答[20]，其表達(dá)水平較啤酒發(fā)酵開始時(shí)上調(diào)了12.75倍。而據(jù)報(bào)道參與細(xì)胞壁合成的上調(diào)了6.29倍。、、、、、、、、、在H/中表達(dá)相對(duì)上調(diào)，其他基因的調(diào)控不明顯。在H5菌株中也發(fā)現(xiàn)了類似的調(diào)控模式，盡管的上調(diào)并不充分。然而，與H/相比，H5中基因沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的調(diào)控。另一方面，大部分基因的調(diào)控在H-Δ中發(fā)生下調(diào)，基因表達(dá)也發(fā)生明顯下調(diào)，而和基因表達(dá)上調(diào)。是與細(xì)胞核的穩(wěn)定性及細(xì)胞形態(tài)相關(guān)的基因[21]，該基因在H-Δ發(fā)生了明顯上調(diào) (11.76倍)。細(xì)胞在發(fā)酵過(guò)程中受到損傷時(shí)，基因可能發(fā)生上調(diào)以維持細(xì)胞的形態(tài)穩(wěn)定。與發(fā)酵開始時(shí)相比，轉(zhuǎn)錄輔助因子Swi6編碼基因的表達(dá)水平上調(diào)了7.45倍。、等細(xì)胞壁應(yīng)激傳感基因[22]在3株菌中均呈現(xiàn)相似的調(diào)控水平。

圖5 H5 (A)、H/rlm1 (B)及H-rlm1Δ (C)的掃描電鏡圖(×8 000)

圖6 H5(A)、H/rlm1 (B、C)及H-rlm1Δ (D、E)的透射電鏡圖(×25 000)

圖7 H5、H-rlm1Δ和H/rlm1中細(xì)胞壁完整性途徑相關(guān)基因調(diào)控水平分析

3 討論

在工業(yè)生產(chǎn)中，由于受到成本的限制，啤酒酵母需要被重復(fù)使用，酵母的自溶一般會(huì)發(fā)生啤酒發(fā)酵的后酵期以及在多次反復(fù)回用之后，目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)啤酒廠的啤酒酵母大多使用代數(shù)為 5代，第5代之后的酵母的生理性能發(fā)生大幅度下降，自溶率顯著增加，造成釀造的啤酒的品質(zhì)與風(fēng)味受到極大的影響。而國(guó)際上優(yōu)質(zhì)的啤酒酵母一般可使用至15代。國(guó)內(nèi)啤酒廠常用的啤酒酵母在傳代使用過(guò)程中，大部分啤酒酵母在使用至第3代時(shí)不會(huì)立即出現(xiàn)自溶的現(xiàn)象，而第4代及第5代發(fā)酵結(jié)束后，抗自溶性能較弱的酵母細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)明顯的自溶現(xiàn)象[16]。啤酒酵母抗自溶性能的提高能夠有效地增加酵母的回用次數(shù)，進(jìn)一步提高生產(chǎn)效率，降低成本。酵母細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是一種進(jìn)化適應(yīng)，使酵母能夠?qū)Σ焕沫h(huán)境條件作出反應(yīng)，并保持細(xì)胞的繁殖力。研究表明轉(zhuǎn)錄因子Rlm1參與了MAPK通路和細(xì)胞壁完整性 (CWI) 途徑的激活[23]，其編碼基因是Mpk1在CWI通路下游的功能基因，也參與了細(xì)胞壁完整性的維護(hù)。如前所述，基因在酵母中表達(dá)不同，其在抗自溶能力較強(qiáng)的啤酒酵母菌中表達(dá)水平較高，而在抗自溶能力較弱的啤酒酵母菌中表達(dá)水平較低[8]。

自溶過(guò)程中，細(xì)胞逐漸喪失生存能力，電子運(yùn)輸、戊糖-磷酸鹽途徑、脂肪酸氧化、糖原分解代謝、海藻糖合成代謝、呼吸代謝等大部分能量的產(chǎn)生和利用也都受到干擾[24]。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)25個(gè)基因在酵母自溶過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的拯救、防御和毒性起作用，其中12個(gè)基因下調(diào)，13個(gè)基因上調(diào)。下調(diào)和上調(diào)的基因均參與了抗氧化應(yīng)激、滲透壓、化學(xué)刺激、熱休克、DNA損傷、pH和饑餓等應(yīng)激反應(yīng)[8]。在酵母自溶過(guò)程中，、、、、等基因被發(fā)現(xiàn)可能有重要的作用[2]。CWI通路是負(fù)責(zé)細(xì)胞壁組織和生物合成的主要系統(tǒng)，在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子Rlm1被招募到和基因的啟動(dòng)子上，激活這兩個(gè)基因啟動(dòng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄重編程[4,25-26]?；虻那贸赡軐?dǎo)致產(chǎn)生了細(xì)胞壁缺陷從而引起了H-Δ細(xì)胞對(duì)米卡芬凈及熒光增白劑抗性的減弱。該基因作為參與CWI激活自調(diào)節(jié)反饋環(huán)的重要基因[25]，其破壞導(dǎo)致反饋環(huán)的破壞，進(jìn)而影響在細(xì)胞壁損傷應(yīng)力下的表達(dá)。啤酒酵母在自溶過(guò)程中會(huì)迅速喪失生存能力，同時(shí)激活一系列應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行改造以適應(yīng)環(huán)境[1]。前期研究中從兩個(gè)不同自溶階段的啤酒酵母菌株的蛋白質(zhì)二維凝膠電泳譜可以清楚地發(fā)現(xiàn)，在自溶過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的大規(guī)模降解以及蛋白質(zhì)數(shù)量的下降，同時(shí)也出現(xiàn)了一些新的蛋白質(zhì)[2]，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)我們推測(cè)啤酒酵母細(xì)胞對(duì)其基因組進(jìn)行了大量的重編程以響應(yīng)環(huán)境變化[8]。酵母細(xì)胞作為一種動(dòng)態(tài)變化的結(jié)構(gòu)，在生長(zhǎng)和發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)氧化劑應(yīng)激、滲透應(yīng)激、乙醇應(yīng)激、饑餓應(yīng)激等多種應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)[1,7,23]。細(xì)胞壁完整性通路調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞使其在惡劣的環(huán)境中能夠遵循嚴(yán)格的規(guī)律來(lái)維持其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整。

酵母在釀造工業(yè)中應(yīng)用廣泛，啤酒酵母更是被認(rèn)為是啤酒發(fā)酵的核心。對(duì)啤酒酵母的基因組測(cè)序工作證實(shí)了其雜交的本質(zhì)[11,27-28]，由于長(zhǎng)期的種內(nèi)及種間的雜交，啤酒酵母的倍性出現(xiàn)了非整倍體等特征，直接對(duì)其進(jìn)行遺傳改造很難清楚地了解某個(gè)基因的功能。本研究所采用的啤酒酵母單倍體菌株H5是從中國(guó)啤酒廠廣泛使用的lager型啤酒酵母菌株中選育而來(lái)的，具有一定的代表性。在單倍體啤酒酵母菌株中研究基因的功能，能夠直觀地了解該基因在啤酒酵母菌中的功能及基因調(diào)控對(duì)啤酒釀造的影響?；蛐揎楇m然不影響菌株的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能，但仍然影響酵母菌株的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致啤酒發(fā)酵結(jié)束后菌株細(xì)胞形態(tài)差異較大。啤酒酵母細(xì)胞在發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)歷了多種壓力脅迫交替出現(xiàn)的歷程，如高滲透壓脅迫、乙醇脅迫、營(yíng)養(yǎng)消耗、罐體壓力等[1,7]，所有這些壓力都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和老化。基因的缺失可能加速了衰老過(guò)程，發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后也發(fā)現(xiàn)了胞內(nèi)細(xì)胞器的損傷。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁組裝及DNA損傷應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)隨的過(guò)表達(dá)與敲除而調(diào)整，而CWI途徑中其他相關(guān)基因的調(diào)控方式并沒(méi)有明顯的規(guī)律，推測(cè)可能主要影響了CWI途徑中基因的表達(dá)，進(jìn)而提高啤酒酵母在惡劣環(huán)境中的抗逆性。

本研究基于同源重組的方法對(duì)進(jìn)行敲除和過(guò)表達(dá)，獲得了重組菌H-Δ和H/。研究了重組菌在啤酒發(fā)酵過(guò)程中的抗自溶性能，發(fā)現(xiàn)敲除影響了酵母的抗自溶能力。敲除了使啤酒酵母對(duì)細(xì)胞壁損傷、氮饑餓、滲透壓的耐受性以及溫度的敏感性受到影響[14]。結(jié)合qRT-PCR發(fā)現(xiàn)CWI途徑中與涉及細(xì)胞壁組裝和DNA損傷應(yīng)答的在過(guò)表達(dá)時(shí)顯著上調(diào)。對(duì)基因的調(diào)控能夠影響酵母的抗自溶能力，為選育抗自溶能力高的啤酒酵母菌株提供參考依據(jù)。

[1] Gibson BR, Lawrence SJ, Leclaire JP, et al. Yeast responses to stresses associated with industrial brewery handling. Fems Microbiol Rev, 2007, 31(5): 535–569.

[2] Xu WN, Wang JJ, Li Q. Comparative proteome and transcriptome analysis of lager brewer’s yeast in the autolysis process. FEMS Yeast Res, 2014, 14(8): 1273–1285.

[3] Rodicio R, Heinisch JJ. Together we are strong-cell wall integrity sensors in yeasts. Yeast, 2010, 27(8): 531–540.

[4] Sanz AB, Garcia R, Rodriguez-Pe?a JM, et al. Cooperation between SAGA and SWI/SNF complexes is required for efficient transcriptional responses regulated by the yeast MAPK Slt2. Nucleic Acids Res, 2016, 44(15): 7159–7172.

[5] Watanabe Y, Irie K, Matsumoto K. Yeast rlm1 encodes a serum response factor-like protein that may function downstream of the Mpk1 (slt2) mitogen-activated protein kinase pathway. Mol Cell Biol, 1995, 15(10): 5740–5749.

[6] García R, Bermejo C, Grau C, et al. The global transcriptional response to transient cell wall damage inand its regulation by the cell integrity signaling pathway. J Biol Chem, 2004, 279(15): 15183–15195.

[7] Gibson BR, Lawrence SJ, Boulton CA, et al. The oxidative stress response of a lager brewing yeast strain during industrial propagation and fermentation. FEMS Yeast Res, 2008, 8(4): 574–585.

[8] Xu WN, Wang JJ, Li Q. Microarray studies on lager brewer's yeasts reveal cell status in the process of autolysis. FEMS Yeast Res, 2014, 14(5): 714–728.

[9] Li XE, Wang JJ, Li Q. Screening and RT-PCR analysis of stress resistant brewing yeast. Food Ferment Ind, 2014, 40(8): 18–23 (in Chinese). 李欣兒, 王金晶, 李崎. 壓力耐受啤酒酵母的篩選及其RT-PCR研究. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2014, 40(8): 18–23.

[10] Wendland J. Lager yeast comes of age. Eukaryot Cell, 2014, 13(10): 1256–1265.

[11] Nakao Y, Kanamori T, Itoh T, et al. Genome sequence of the lager brewing yeast, an interspecies hybrid. DNA Res, 2009, 16(2): 115–129.

[12] Xu WN. Study on the evaluation and mechanism of autolysis in lager brewer’s yeast[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2014 (in Chinese).許維娜啤酒酵母自溶評(píng)價(jià)及機(jī)理研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2014.

[13] Ding HJ. Physiological and autolysis properties of brewer's yeast during passage [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2018 (in Chinese).丁華建. 啤酒酵母在傳代過(guò)程中的生理與自溶性能研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2018.

[14] Ding HJ, Duan HX, Wang JJ, et al. Comparison of physiological performance differences between two lager yeasts during serial re-pitching and autolysis. Food Ferment Ind, 2018, 44(10): 57–64 (in Chinese). 丁華建, 段鴻緒, 王金晶, 等. 兩株lager啤酒酵母在傳代及自溶過(guò)程中生理性能差異的比較. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2018, 44(10): 57–64.

[15] Martínez-Rodríguez AJ, Polo MC, Carrascosa AV. Structural and ultrastructural changes in yeast cells during autolysis in a model wine system and in sparkling wines. Int J Food Microbiol, 2001, 71(1): 45–51.

[16] Dodou E, Treisman R. Themads-box transcription factor Rlm1 is a target for the Mpk1 mitogen-activated protein kinase pathway. Mol Cell Biol, 1997, 17(4): 1848–1859.

[17] Orlean P. Architecture and biosynthesis of thecell wall. Genetics, 2012, 192(3): 775–818.

[18] Venters BJ, Wachi S, Mavrich TN, et al. A comprehensive genomic binding map of gene and chromatin regulatory proteins in. Mol Cell, 2011, 41(4): 480–492.

[19] Nuoffer C, Jen? P, Conzelmann A, et al. Determinants for glycophospholipid anchoring of theGAS1 protein to the plasma membrane. Mol Cell Biol, 1991, 11(1): 27–37.

[20] Eustice M, Pillus L. Unexpected function of the glucanosyltransferase Gas1 in the DNA damage response linked to histone H3 acetyltransferases in. Genetics, 2014, 196(4): 1029–1039.

[21] Niepel M, Molloy KR, Williams R, et al. The nuclear basket proteins Mlp1p and Mlp2p are part of a dynamic interactome including Esc1p and the proteasome. Mol Biol Cell, 2013, 24(24): 3920–3938.

[22] Kim KY, Truman AW, Caesar S, et al. Yeast Mpk1 cell wall integrity mitogen-activated protein kinase regulates nucleocytoplasmic shuttling of the Swi6 transcriptional regulator. Mol Biol Cell, 2010, 21(9): 1609–1619.

[23] Levin DE. Regulation of cell wall biogenesis in: The cell wall integrity signaling pathway. Genetics, 2011, 189(4): 1145–1175.

[24] Wang JJ, Li MQ, Zheng FY, et al. Cell wall polysaccharides: Before and after autolysis of brewer’s yeast. World J Microb Biot, 2018, 34: 137.

[25] Monerawela C, Bond U. Brewing up a storm: The genomes of lager yeasts and how they evolved. Biotechnol Adv, 2017, 35(4): 512–519.

[26] Baker E, Wang B, Bellora N, et al. The genome sequence ofand the domestication of lager-brewing yeasts. Mol Biol Evol, 2015, 32(11): 2818–2831.

[27] Ishihara S, Hirata A, Nogami S, et al. Homologous subunits of 1,3-beta-glucan synthase are important for spore wall assembly in. Eukaryot Cell, 2007, 6(2): 143–156.

[28] Martin-Yken H, Dagkessamanskaia A, Basmaji F, et al. The interaction of Slt2 MAP kinase with Knr4 is necessary for signalling through the cell wall integrity pathway in. Mol Microbiol, 2003, 49(1): 23–35.

Regulations ofgene affect the anti-autolytic ability of lager yeast

Jinjing Wang1,2, Mengqi Li1,2, Dan Hou1,2, Weina Xu1,2, Feiyun Zheng1,2, Chunfeng Liu1,2, Chengtuo Niu1,2, and Qi Li1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 Laboratory of Brewing Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

The autolysis of brewer’s yeast seriously affects the quality of beer and the quality of yeast is considered as one of the key factors in beer brewing. Previous studies on brewer’s yeast autolysis showed thatgene, an important transcription factor in cell integrity pathway, is closely related to the autolysis of yeast. In this study,was knocked out and overexpressed in a haploid brewer’s yeast.disruption resulted in poor anti-autolysis performance of yeast, whereas overexpression ofcontributed to the anti-autolytic ability of yeast. In addition,gene knockout affected the osmotic stress resistance, cell wall damage resistance, nitrogen starvation resistance and temperature tolerance of yeast strain. The transcriptional level ofinvolved in cell wall assembly and DNA damage response was regulated along with the expression of, whereas other genes in CWI pathway did not show apparent regularity.might mainly affect the expression ofso as to improve the stress resistance of lager yeast in harsh environment. The result from this study help further understand the mechanism of yeast autolysis and lay a foundation for breeding brewer’s yeast strain with better anti-autolytic ability.

lager yeast, anti-autolytic ability,, cell wall integrity

December 24, 2018;

February 28, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31771963, 31571942).

Jinjing Wang. Tel/Fax: +86-510-85918176; E-mail: jjwang@jiangnan.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31771963，31571942) 資助。

2019-03-21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190321.1053.001.html

10.13345/j.cjb.180530

王金晶, 李夢(mèng)琦, 侯丹, 等. Lager啤酒酵母基因調(diào)控對(duì)其抗自溶性能的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(6): 1059–1070.

Wang JJ, Li MQ, Hou D, et al. Regulations ofgene affect the anti-autolytic ability of lager yeast. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 1059–1070.

(本文責(zé)編 郝麗芳)